cDNA文库组标准流程六(电转化流程).pdf

中国试剂网 3.20.1.4 cDNA 文库组标准流程六( 电转化流程) 1． 电转化感受态细胞的制备 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB 液体培养基的50ml 离心管中。 （同时做培养基和枪头的空白对照） 2. 37 ℃，220rpm，培养14-16 个小时。 3. 第二天，以 1：100 的比例将这10ml 菌液倒入 1000ml LB 液体培养基中， 37 度，220rpm，振摇2-3 小时，每半小时测一次OD，当OD 值达到0.3-0.4 时， 停止培养。 4. 将菌液在冰上预冷 30 分钟，随后将菌液分装到 500ml 预冷的离心杯中，4 ℃，2500rpm 离心10 分钟。 5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4 ℃，4000rpm 离心10 分钟。 6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm ，4 ℃， 离心10min。 7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷) ，重悬菌体，再加满10% 甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10 ％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/ 管分装于1.5ml 的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl 感受态加0.01ng puc18 直接电穿孔转化，检测转化效率。 9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 2 ．连接产物纯化 1.将连接产物转移至一 1.5ml Eppendorf 管中，加入下列试剂: 10ul of ddH2O 2ul of 3M NaAC （PH5.2 ） 50ul of 无水乙醇 轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1 小时以上； 2.4 ℃，top Speed 离心30 分钟； 3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物； 4.加入500ul70 ％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 中国试剂网 3.20.1.4 5.4℃，top Speed 离心5 分钟； 6.小心移去上清，将此Eppendorf 管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10ulddH2O 重新溶解沉淀，4 ℃短期保存，-20℃长期保存备用； 3. 电转化 1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻； 2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml 的离心管中，将其和0.1CM 的电极杯一起置 于冰上预冷。 3. 将40～100ul 解冻的感受态细胞转移至此 1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰 上放置10min。 4. 打开电转仪，调至Manual ，调节电压为2.1KV 。 5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电 极杯的底部； 6. 将电极杯推入电转化仪，按一下 pulse 键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速 加入1000μl 的SOC 液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml 的离心管中。 7. 37℃，220 －250rpm 复苏1 小时。 8. 取20ul 转化产物加 160ulSOC 涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转 化结果。其余菌液加1：1 的30 ％的甘油后混匀－80℃保存。 注：每块加有Amp 的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl 。 4. 电击杯清洗流程 1．用清水将电击杯稍冲一下。 2 ．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr 。 3 ．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3 遍，然后用 1ml 的枪吸取超纯水反复吹打电 击杯 10 遍以上。 4 ．加入无水乙醇2ml 于电击杯中，浸泡30 分钟。 5 ．弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 6 ．将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。 注：1．不同样品使用的电机杯应分开； 2 ．每周用1％酒精浸泡30 分钟。