蛋白质表达和抗体制备.ppt

在基因克隆的研究工作中，人们的主要兴趣往往不在目的基因本身，而是其编码的蛋白质产物，特别是那些商业上、医疗上以及科研工作中具有重要意义的蛋白质。最为快速简便的方法就是将这些蛋白质的基因克隆到特定表达载体上。使其高效率的表达。 * 各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性。 对于我们来说，最常用和最需掌握的是大肠杆菌表达系统 * 一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。 * * 如果目的蛋白用于分析级的活性分析、筛选与配体相互作用的蛋白质、制备抗原时，通常与一些融合标签进行融合表达。这些融合标签使得目的蛋白易于分离和纯化，并且有利于增加蛋白质的稳定性。如His、GST、Flag、MBP、还有一些荧光蛋白。 外源蛋白在大肠杆菌中能够高效表达，主要取决于好的表达载体，好的表达载体一般采用强的启动子和终止子，以及合适的SD（核糖体结合）序列，其中最关键的是启动子，目前常用的大肠杆菌表达系统常用Lac、Trp、Tac、T7、PL或P8等启动子。 * 比如说Lac启动子：Lac是中等强度的启动子，此表达系统是以大肠杆菌的乳糖操纵子为基础构建的。它包括阻遏基因Lac I、启动子Lac P、操纵基因Lac O,以及结构基因Lac Z（B-半乳糖苷酶）、Lac Y（半乳糖苷渗透酶）、Lac A(半乳糖苷转酰酶）。 原核基因表达也是比较高效的，不会白白浪费资源，在缺乏乳糖的条件下Lac I基因的产物阻遏蛋白会与Lac O结合，使转录关闭，而在有乳糖或IPTG（异丙基-B硫代半乳糖苷）等条件下，它可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶，这就是当大肠杆菌的培养基中只有乳糖时利用乳糖的原因。 * T7启动子表达水平最高，是以大肠杆菌T7噬菌体转录元件为基础构建。T7噬菌体1所编码的RNA聚合酶活性很高，激活T7的启动子转录，转录活性和效率远远比大肠杆菌本身的酶和启动子高。T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系。。最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高水平。pET系列载体(如pET-3等）是经典的T7噬菌体启动子表达载体。此类表达系统必须包含T7噬菌体RNA聚合酶和T7噬菌体启动子。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶。 目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录翻译信号控制，表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效，并具有选择性，充分诱导时几乎所有的细胞资源都用来表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可占到细胞蛋白的50%左右。 噬菌体DE3是一种衍生噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lac I基因，lac UV5启动子（是一个突变体，可以在没有CAP的情况下正常转录，因此只收到Lac I蛋白的调控，比一般的lac启动子更容易掌控，CAP、CAMP形成复合物与启动子DNA结合，激发转录过程。）以及T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因。一旦形成DE3溶源状态，就只有受IPTG诱导的Lac UV5启动子指导的T7 RNA聚合酶转录，在溶源培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶产生，继而启动质粒上的目的DNA开始转录。 * 表达系统的另外一个重要组分就是宿主菌，一般能导入质粒或其他小片段DNA并正常表达的菌株均可作为宿主菌。但是由于表达的是外源蛋白质，大肠杆菌缺乏复杂的蛋白质后加工和折叠系统等原因，表达产物有时会活性很低、降解严重，因此必须筛选或者构建合适的表达宿主菌。现在常用的宿主菌为BL21（DE3）（T7噬菌体启动子系统）等。带有染色体T7 RNA聚合酶基因的宿主菌蛋白质表达水平较高。这些菌株都是噬菌体DE3的溶源菌。为了使外源蛋白更加稳定和高效表达，许多研究人员在此基础上进行了改造，现在已经开发出一系列优化的表达宿主菌，包括蛋白酶缺陷型表达宿主菌、补充稀有密码子型表达宿主菌等特性的DE3溶源菌。 * * 在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在(蛋白可溶并不意味着蛋白