凝胶过滤层析的基本操作.pdf

凝胶过滤层析的基本操作 ① 凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。 对于未知蛋白， 应选用分离范围 较宽的凝胶， 如用 Sephacryl S-300 。对于分子量在 3~5kDa 的蛋白质， 脱盐时应选用 Sephadex G 50 或 G 25 ；而对于小分子量多肽物质 （1~5kDa ），脱盐则应选用 Sephadex G 10 或 Sephadex G 15 。 ② 凝胶介质的处理和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下， 1 份凝胶加十份水，自然溶胀至少 24 小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃 去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时 具有灭菌的作用。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为 50~100:1 。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约 1/3 柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液 =3 ：1）搅拌均匀， 缓慢并连续地一次性注入柱内。 装柱过程中， 要避免柱内缓冲液流干， 注意保持柱体凝胶均 匀无气泡和裂缝。装完后，可用 2 ml 蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可 见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶， 不留任何条纹。 要保持凝胶和缓冲液温度一致， 以减少气 泡的产生。 ③ 上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。 样品体积不应超过柱床体积的 1~5 %，如超 过 5 % ，则会导致分离效率降低，低于 1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可 能浓缩至 10~20 mg/ml 。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过 2 ，样品粘度过高，会使层 析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经 0.2 μm 孔径滤膜过滤或 10， 000 g 离心 5 min ，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④ 洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作 用。 Sephadex 和 Sepharose CL 凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为 0.02 mol/L ； Sephacryl 凝胶应为 0.05 mol/L 。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达 0.2 mol/L ，以保证蛋白 质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在 1ml/min 左右，低流速 可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。 ⑤ 分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。 ⑥ 层析柱的再生与保存 洗脱完成后，继续用 3-5 个柱床体积缓冲液洗涤柱体，即可使凝胶再生。也可用 0.2 mol/L NaOH 或 1 mol/L NaCl 或非离子型去垢剂 0.2~1% NP-40 去除吸附过紧的杂质，再用双蒸水 充分洗脱除去离子，加 0.02% NaN 3 （抑菌剂）保存。也可在 20 % 乙醇中保存（如 Sephacryl HR 或 Sepharose CL 等）。 目前常用的凝胶介质 ① 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 是以葡聚糖为基本骨架， 含大量羟基， 亲水性高。 不溶于弱酸、 碱、盐、有机溶剂及水。但在强酸中，凝胶的糖苷键易水解。如果长期与氧化剂接触，也容 易被破坏。 ② 交联丙烯基葡聚糖凝胶（ Sephacryl ） 是由丙烯基葡聚糖与