葡聚糖凝胶层析法.pdfVIP

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法； 一、实验目的； 1. 掌握凝胶层 析的基本原理； 2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实； 二、实验 原理；凝胶层析法也称分子筛层析法， 是利用具有一定孔径大； 将凝胶装在柱后， 柱床体积称为“总体积”，以 Vt 表；式中 Ve 为洗脱体积，自加入样品时算起， 到组分最大；上式中 Ve 为实际测得的洗脱体积； Vo 可用不被凝胶；如果假定蛋 白质 实验一 蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1. 掌握凝胶层析的基本原理。 2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法， 是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定 相的层析技术。 当混合物随流动相经过凝胶层析柱时， 其中各组分按其分子大小 不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、 呈珠状颗粒的物质， 每个颗 粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致， 像筛子， 小的分子可以进入凝胶网孔， 而 大的分子则排阻于颗粒之外。 当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此 类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时， 这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。 大 分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动， 流程短，移动速率快，先被洗出层析柱； 而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部， 然后再扩散出来， 故流程长， 移动 速度慢， 最后被洗出层析柱， 从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。 若分 子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质， 则居二者之间从柱中流出。 总 之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子， 最终由于它们被排阻和扩散的程度不 同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以 Vt 表示。实质上 Vt 是由 V i 与 Vg 三部分组成， Vo 称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积； Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。 Vg 为凝胶本身的体积。洗脱体积 （Ve）与 Vo 与 Vi 之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中 Ve 为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所 流出的体积； Kd 为样品组分在二相间的分配系数，也可以说 Kd 是分子量不同的 溶质在凝胶内部与外部的分配系数。 它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒 孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数， 与柱的物理条件无关。 Kd可通过实验求得，上式可以改写为 :Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中 Ve 为实际测得的洗脱体积； Vo 可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶 液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约 200 万的蓝 色葡聚糖 -2000 等）通过实际测量求得； Vi 可由 g×Wr 求得（ g 为干胶重量，单 位为克； Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床 来说，只要通过