原核表达系统(PPT).ppt

* 原核表达系统 ***基因公司技术讲座*** 原 核 表 达 系 统 分 类 分 类 方 式 分 类 表达调控方式 组成型，诱导型 表达产物定位 分泌型，不分泌型（细胞内、细胞膜、周质空间） 产物纯化方式 是否融合蛋白、是否一步亲和纯化 产物溶解状况 可溶、包含体、分泌型 Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 * 基因功能研究 * 重组蛋白特性研究 * 重组蛋白制备/制药 主 要 用 途 Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 NEB 公 司 的 IMPACTTM 系 统 Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag 采用了必威体育精装版的“可诱导的内含肽自身剪切 ”技术，使内含肽在适当的pH或还原条件进行自身剪切，无需另外加入蛋白酶就可将目的蛋白经过一步亲和层析从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯化效率。 Intein CBD MCS Target Gene Chitin Binding Domain Chitin-bound intein tag Multiple cloning site 世界首创 独家提供 内 含 肽 （Intein) 内含肽是一种蛋白剪切元件（Protein splicing element), 是一些读框区中打断宿主基因 编码区的序列。与内含子(Intron) 不同的是，它们是在翻译后通过自身催化的蛋白剪切机制从蛋白前体中被剪切的。 InBase(The Intein Database) NEB’s web site: Technical Resource section IMPACT-CN 系 统 特 点 * 操作灵活——目的蛋白可在C端或N端与标记融合 * 目的蛋白产物序列不变 * 一步亲和纯化——无需另加蛋白酶除亲和标记 * 严谨的转录控制 * 目的蛋白能够进行C端标记 独家的Intein 介导的肽连接技术（IPL） IMPACT-CN 系 统 流 程 IMPACT-TWIN 系 统 特 点 * 操作灵活——目的蛋白可在C端或N端与标记融合 * 目的蛋白产物序列不变 * 一步亲和纯化——无需另加蛋白酶去除亲和标记 * 可选择硫醇试剂或pH和温度条件诱导Intein 自身剪切 * IPTG诱导的T7启动子，可实现高水平表达及严谨的表达调控 * 唯一可直接产生带N端Cys 和C端硫酯 的蛋白的表达纯化系统 纯化产物可方便地进行标记、连接及环化等操作 独家的Intein 介导的肽连接技术（IPL） Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 IMPACT-TWIN 系 统 流 程 Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 Protein cyclization Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 NEB 公 司 的 IMPACTTM 系 统载 体 选 择 pMAL蛋白融合及纯化系统 特 点 * 表达量高，稳定可靠 经验证，75%以上的样本产量高达100mg/L * 产物可分布细胞质或周质空间 分布周质空间可增强有二硫键的蛋白的折叠 * 与MBP融合可增加表达蛋白的溶解性 * 温和洗脱条件 不用去垢剂及强烈变性 A1:未诱导细胞 A2:诱导细胞 B1: 直链淀粉柱第一次纯化 B2: Factor Xa 处理后 B3: 直链淀粉柱第二次纯化 pMAL-C2: 无信号顺序，融合蛋白产物定位于细胞质中 pMAL-P2: 含信号顺序，融合蛋白分泌表达于细胞周质 载 体 选 择 PRO Bacterial Expression System Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 ----- CLONTECH----- 特 点 * 严谨调控，高水平诱导表达 新型的杂合启动子和操纵子，低背景，高表达，调控精确，可用于有毒或抑制生长的蛋白表达。 * 产物便于纯化 N-端带有c-Myc 亲和标记和肠激酶位点 * 改造方便 载体的三个主要的功能区各配有单一酶切位点，用户可根据需要对载体进行改造。 PRO Bacterial Expression System ----- CLONTECH----- Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 PRO Bacterial Ex