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实验指导 指导老师：习欠云 实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达 实验目的  了解IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖）诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。 实验原理 将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。 没有加入IPTG诱导剂的时候，lacⅠ产生的阻遏蛋白与lac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入IPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行初步鉴定。 Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 实验内容 材料：大肠杆菌菌株DH5α和BL21以及表达载体PET-32а（+） 主要试剂： LB平板（含50μg/ml的卡那霉素），100mMIPTG,10mg/ml的溶菌酶（10mM Tris-HCl,pH8.0配制）。 Amp（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成100mg/ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。 LB液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，冷却后4℃保存。 LA液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至60℃左右时，加入Amp至浓度100μg/ml，4℃保存。 LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%（w∕v)，高压灭菌，冷却至约50℃后分装如灭菌平皿中，凝固后4℃保存。 LA固体培养基：待灭菌好的LB固体培养基的温度降至60℃左右时，加入Amp至终浓度100μg/ml，摇匀后分装入灭菌平皿中，凝固后4℃保存。 50×TAE:750ml去离子水中加入242gTris,57.1ml 乙酸，Na2EDTA 37.2g,用去离子水定容至1000ml。 IPTG（1mol∕L):8ml去离子水溶解2.3831gIPTG后定容至10ml，再用0.22μm滤膜过滤除菌分装入1.5ml Eppendenf灭菌离心管中，-20℃保存。 实验仪器与设备 空气摇床，生化生化陪养箱 Eppendenf 5804R 低温高速离心机 Eppendenf Gentrifuge 5410D 台式高速离心机 Eppendenf BiopHotometer METTLER TOLEDO AB204-E分析天平 TS-1脱色摇床 超净工作台 水浴摇床 垂直电泳槽 凝胶成像系统 操作步骤 1 大肠杆菌BL-21感受态细胞的制备。 2 重组质粒pET-32а（+）-actRⅡB转化到大肠杆菌BL-21细胞。 3 将含有重组表达载体pET-32а（+）-actRⅡB和空表达载体pET-32а(+)的大肠杆菌BL21划线接种在LB平板上，37℃培养过夜，直至平板上生出菌落。 4 挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右，4℃放置过夜。 5 将LB-PET-32а（+）-actRⅡB菌液接种到3mlLA液体培养基中，37℃，200rpm振摇培养过夜。 6 取100μL培养过夜的菌液接种到3mlLA液体培养液中，37℃，200rpm振摇培养至OD600至0.6-0.8时，加入1M的IPTG,使IPTG终浓度分别为1mM,置37℃摇床继续诱导培养6h，收集菌体置-20℃保存备用。 7 另取不含目的基因片段的质粒pET-32а（+）转化BL21感受态细胞做相同处理，加IPTG诱导6h作对照。 注意事项 1 大肠杆菌的表达水平与IPTG浓度、诱导时间、温度以及宿主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节IPTG的浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。 2 菌液的OD值要摇到0.6-0.8，否则会直接影响到蛋白的表达量。 思考题 1、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？