第二章生物制药技术及单元操作.ppt

2　生物制药技术与单元操作 2.1 基因工程技术 基因工程技术，又称DNA重组技术。通过基因工程技术操作，可以将外源DNA通过载体引入其它物种的细胞，赋予宿主细胞新的遗传特性或产生该宿主原来并不产生的新代谢物，并能遗传该特性。 基因工程的原理是选择合适的外源目标DNA，然后通过体外操作将其整合到载体上，通过载体转入宿主细胞，并成功地在宿主细胞内稳定遗传和高效表达。 1966年，发现了DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶 Hind Ш，使DNA分子的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。 1972年，美国斯坦福大学博格（Berg）研究小组利用限制性内切酶EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。 　　　　基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法， 按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使 之稳定地遗传给后代。 2.1.1 基因工程的操作程序 1.克隆与克隆化 克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分子克隆。 2.DNA克隆 在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。 3.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物－蛋白质。 基因工程的基本操作程序应包括： 目的基因的获取； 目的基因与载体DNA体外重组； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选并鉴定无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）； 外源基因的表达。 1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用 2．人工合成 　根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 3.从mRNA合成cDNA 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA） 4．从基因文库中筛选 5．利用PCR合成＊ 以生物体的RNA序列为模板，经反转录形成cDNA分子，再予以克隆。由于用以克隆的cDNA分子通常只有几个kb大小，所以很适合用质粒作载体。 构建cDNA文库的程序：（1）制备含有polyA的RNA；（2）cDNA的合成；（3）cDNA与载体的连接；（4）转化。cDNA与载体分子形成重组分子后，转入受体菌株（如大肠杆菌），当不同的重组分子含有不同的基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这个转化子群体构成了该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。  荧光染料EB染色的原理 EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(EthidiumBromide)。EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。 2.1.2 基因克隆的酶学基础