第八章原位杂交组织化学.ppt

第八章 原位杂交组织化学 原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。 应用： 研究单一细胞中编码各种蛋白质，多肽的相应mRNA 的定位，从分子水平研究细胞内基因的表达及有关因素的调控。主要用在细胞或组织的基因表达，染色体分析，病毒诊断和发育生物学。 一、原位杂交的由来与发展 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。 自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆、 质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。  1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 与此同时， Buongiorno–?Nardelli和Amaldi,?John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位 杂交细胞或组织化学技术。 1970年 Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒 DNA在细胞中的定位。 按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种： 液相杂交： ~ 参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 液相分子杂交技术包括： ① 吸附杂交 ② 发光液相杂交 ③ 液相夹心杂交 ④复性速率液相分子杂交 固相杂交： ~是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 固相杂交有： ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交 ④ Northern印迹杂交 ⑤ 组织原位杂交 原位杂交属于固相核酸分子杂交的范畴，但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术： 菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交； 斑点杂交是检测特定的DNA片段； Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段； Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定RNA片段； —— 它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。 （二）原位杂交技术的发展 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。 Bauman（1981）等首先应用荧光素标记 cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。 Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。 ----这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 本法的优点: 磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。 Brigat（1983）首创生物素标记探针技术。生物素标记探针技术又叫酶促生物素标记技术，是目前应用最广泛的技术之一，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。 另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸，该法目前也有应用，但不广泛。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。 Boeringer?Mannhem?Bio－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质