细胞生物学研究技术和方法.ppt

第二章 细胞生物学实验技术和方法;—、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。;;显微镜的结构;显微镜的光路 ; 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长； N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2； n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，显微镜的最大有效倍数为1000X。;表一、几种介质的折射率; 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin α /2的最大值小于1；镜口率最大约1.6； 普通光线的波长为400~700nm，;（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope;Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green;（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;laser confocal scanning microscope, LCSM;;LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) /;（四）暗视野显微镜;（五）相差显微镜;原理;用途：观察未经染色的玻片标本。;（六）倒置显微镜;二、电子显微镜;1. 原理;表二、不同光线的波长;TEM LIGHT PATHWAY;TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM;2. 制样技术;2）负染技术;3）冰冻蚀刻;（二）扫描电子显微镜;Scanning electron microscope（ SEM）;工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。;SEM LIGHT PATHWAY;人类红细胞;酵母;（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM;三、显微操作技术micromanipulation technique;显微操作仪;;第二节 细胞和亚细胞组分的测定;（一）固定 物理固定：血膜空气干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。;（二）显示方法;二、免疫细胞化学法 immunocytochemistry;三、放射自显影术;四、细胞分离技术;（一）差速离心 Differential centrifugation;低速;（二）密度梯度离心;1. 速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;二、流式细胞术;三、细胞电泳;第三节 细胞培养与细胞融合;原代培养 （primary culture）：即：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage），每代细胞分裂约3-6次。 细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。;表三、实验室中常用的几种细胞系;Plant Cell Culture;二、细胞融合