目的基因及载体DNA连接.ppt

第六章 目的基因与载体DNA 的连接 目的基因与载体DNA的连接 ——形成重组体DNA 重组体DNA：载体DNA+引入的DNA 连接过程即DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切酶和DNA连接酶的作用，部分还要要借助其他酶。 连接方式（基因与载体DNA的结构特点） 一、粘性末端DNA的连接 1、单酶切粘性末端 2、双酶切粘性末端 3、不规则粘性末端 二、平末端DNA的连接 1、直接连接法 2、同聚物加尾法 3、衔接物连接法 4、DNA接头连接法 5、PCR法引入酶切位点的连接 一、粘性末端DNA的连接 1、单酶切粘性末端 2、双酶切粘性末端 3、不规则粘性末端 1、单酶切粘性末端 仅有一种限制性核酸内切酶酶切产生的粘性末端，如EcoR Ⅰ 限制性内切酶 DNA连接酶 缺点： （1）易发生自我环化作用： 可用碱性磷酸酶处理，目的DNA的5’-P转化为5’-OH，连接导入受体细胞后，自动修复。 （2）发生非定向连接： 因单酶切，粘性末端都一样，两个方向插入都可。 2、双酶切粘性末端 由两种内切酶酶切产生的DNA片段所具有的粘性末端： （1）同尾酶酶切 两粘性末端相同，连接类似于单酶切方式。 （2）非同尾酶酶切 产生的两粘性末端不同，可发生定向连接。 优点： 其中非同尾酶酶切产生的两粘性末端不同，可定向插入外源目的基因，但需要确切知道原始DNA具有两种酶切位点。 3、不规则粘性末端 用机械切割法制备的DNA片段，或化学合成的DNA片段，所产生的粘性末端，不互补。 一般转化为平末端进行连接。 采用常规的直接连接。 步骤： （1）S1核酸酶处理，使之变成平末端，或用聚合酶补平成平末端； （2）T4DNA连接酶连接平末端。 缺点： 平末端DNA片段间的进行连接作用，在效率上明显低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后，不能原位删除下来。 同样存在非定向连接问题，故很少使用。 二、平末端DNA的连接 1、直接连接法 2、同聚物加尾法 3、衔接物连接法 4、DNA接头连接法 5、PCR法引入酶切位点的连接 2、同聚物加尾法 1972年，美国斯坦福大学的P.Labban 和D.Kaiser 联合开创的可连接任何两段DNA分子的普遍性方法。 主要利用末端脱氧核苷酸转移酶。不需模板就可进行链的延伸。 3、衔接物连接法 衔接物：是一种人工合成的具有一个或多个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。 如：具有BamHⅠ酶切位点的衔接物。G-G 与具有同样酶切位点的载体连接或使用双衔接物。 4、DNA接头连接法 接头：是人工合成的具有突出的黏性末端的寡核苷酸片段。 如：具有BamHⅠ酶切位点的接头。 DNA接头在与目的基因连接前，需要用碱性磷酸酶处理，使5’P转化为5’OH，避免发生自身连接。 5、PCR法引入酶切位点的连接 * * 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 总体技术路线 限制酶 EcoR Ⅰ 同种内切酶生产的粘性末端的连接 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 同尾酶产生的粘性末端的连接 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 T ACTAG 5 5 GATCA T 5 退火 G CCTAG GATCC G 5