纤维素酶产生菌的鉴定、分离方法.docx

纤维素酶产生菌的鉴定、分离方法 土壤中纤维素酶产生菌的鉴定与分离 一、实验基本流程 采样 ㈡ 富集培养 ㈡ 稀释梯度 ㈡ 刚果红染色法鉴定与分离 二、 、实验材料 仪器及试剂：250ml锥形瓶（2个）、250ml烧杯（2个）、天平、药匙、玻璃棒（1根）、 电炉、摇床、玻璃珠、称量纸、试管（7支）、无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、 移液管（3根 、培养箱、10mg/ml的刚果红（CR)溶液、纱布、绳子、报纸等 培养基：纤维素分解菌的选择培养基、鉴别纤维素分解菌的培养基 三、 实验步骤 1、 土样的采集 土壤中的微生物，大约70%?90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生 长，绝大多数分布在距地表约3?此ni的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。 另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚 集较多的分解纤维素的微生物。（纤维素降解菌株往往可到森林的腐草烂叶下面的土壤或直 接采集腐草烂叶來分离获得） 2、 选择培养 富集培养基 在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菡的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分 解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。 富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、 称量纸等。 选择培养菽的制备比例见下:纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉5gNaN03lgNa2IIP〇4 ? 7 选择培养菽的制备比例见下: 纤维素分解菌的选择培养基 纤维素粉 5g NaN03 lg Na2IIP〇4 ? 7II20 〇.5g KH2PO4 〇. 9g MgSOt ? 7H20 〇. 5g KC1 〇. 5g 酵母膏 〇? 水解酪素 〇. 5g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000ml 称取土样20g,在无菌条件下加 入装有50ml培养基的锥形瓶中。将 瓶置于摇床上，在30°C下振荡培养 3?4d,至培养基变浑浊。 所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液管（II艮〉、培养箱等。 需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液管。 ①鉴別培养基的制备 培养基的制备比例如下:鉴别纤维素分解菌的培养基羧甲基纤维素钠CMC-Na5-10g酵母膏lgKH2P040. 25g琼脂15g土豆汁100ml将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到 ①鉴別培养基的制备 培养基的制备比例如下: 鉴别纤维素分解菌的培养基 羧甲基纤维素钠CMC-Na 5-10g 酵母膏 lg KH2P04 0. 25g 琼脂 15g 土豆汁 100ml 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000ml 将上述己倒培养基的十个平板 底而分别用记号笔写上10 4, 10 5,10力三种稀释度（每个稀释度写3个）和一个空白平板（留作对照用）。然后用移液管分 别由10 10_5, 10-6三管土壤稀释液中各吸取0. lml对号放入已写好稀释度的平板中，用无 菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5?lOmin,使菌液吸附进培养基。30 °C倒置培养，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 ③菌落形态观察 1?2d后，平板上长出菌落，并在个别菌落周围山现明显的透明圈。 挑菌2种，根据菌落大小、形状、高度、千湿等特征记录不N的菌落形态特征。 菌落 大小 形态 干湿 高度 透明度 颜色 边缘 1 2 ④划线分离 将步骤①中的鉴别培养基加热熔化后倒入2个无菌平皿中，凝固后，川接种环挑取③中 2种菌落在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒賈于温室培养，至长出单 菌落。 由此，即从土壤中分离纯化出纤维素酶产生菌。 四、实验评价： 1、 培养基是否有杂菌污染？是否分离到了能够产生透明圈的微生物？它们是纤维素分 解菌吗？ 2、 你是否设置了对照组？有什么现象？你能得山什么结论？ 3、 不同土样的结果是否相同？ 4、 比较你的分离结果与其他同学的有什么不同？分析产生结果不同的原因。 5、 总结本实验，归纳实验过程中的成功之处和不足，互相交流。 (2) 梯度稀释 所需仪器：试管（7支）、移液管（2根）。 需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液管。 用量程为1000此的移液管从富集培养土壤液中吸取iinl 土壤悬液加入盛有9ml无菌水 的试管中充分混匀。然后换移液管从此试管中吸取iml加入另一盛有9ml无菌水的试管中， 混合均匀，以此类推制成10—1，〗〇_2, 10—3,1〇_5, 10—6不同稀释度的土壤溶液。 (3) 刚果红染色法分离（涂布平板）