细胞传代冻存复苏步骤.docVIP

. . 准备工作： 1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30-50min，过后，关闭紫外灯，通风10min。 2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基开紫外时即将当天实验所用物品拿出，室温放置一段时间 开紫外时即将当天实验所用物品拿出，室温放置一段时间 注意事项： 1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。 2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。 3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。 开始工作： 1、实验前换衣帽，开风淋，吹风。 2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。 3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。 4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。 5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。 6、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。 7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头。 8、将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的：提高酶活性，促进消化。 9、取待用细胞，取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。 10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。 11、离心5min，1000转/min。 以下分别介绍： 一 换液 1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。 2、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。 3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。 4、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。 5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。 6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。 7、将细胞置于5%CO2、37度培养箱培养。 二 传代 1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，吸取已配制的培养基适量，加入离心管中，将细胞重悬、吹匀。 2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中，培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞，镜下观察，细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。 三 冻存 1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。 2、按胎牛血清：DMSO=9:1的比例配制冻存液，装入青霉素瓶中。 3、用移液管将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。 4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口，标签。 5、冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱1小时，然后放置-20度冰箱2小时，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌中保存。 四 种板 1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。 2、取培养瓶及小烧杯各一只，摆放好。 3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。 4、先移取2ml，5ml，20ml完全培养液,分别加入到离心管，培养瓶，小烧杯中。 5、混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取适量细胞悬液移入培养瓶，吹散细胞。镜下观察，细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。（细胞传代目的） 6、取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约10μl），弃掉枪头，滴入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数），镜下观察细胞数（每个象限5个细胞，总和20个细胞，5×104个），不断调整小烧杯中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。 7、取1个96孔板，用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周，孔板盖在酒精灯上烤一下。 8、用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约100μl），依次滴入96孔板中（枪头至孔下1/3处），同时用移液枪吸取完全培养液（约100μl）作为对照或调零，边缘孔用无菌PBS填充。 9、滴完后，仍用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周。 10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培养箱中进行培养。 五 MTT实验 1、接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl。 2、称取3mg MTT粉末，加6ml完全培养液，配制成浓度5%的MTT溶液，0.22μm的微孔滤膜除菌。 3、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 4、培养3－5天后，取出96孔板，用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周，孔板盖在酒精灯上烤一下。 5、用（120μl）移液枪小心吸弃孔内培养上清液（包括调零孔内的培养上清液），弃去枪头。再用移液枪按每孔100μl加MTT溶液也包括调零孔，但边缘孔除外（枪头在孔上1/3处）。 6、呈色：继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养