多肽复合物／树突状细胞疫苗研究.ppt

gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗的实验研究 gP96的提取 提取gP96的经典方法（Srivastava）： 饱和硫酸铵沉淀 刀豆球蛋白A亲和层析 DEAE离子交换层析 （提取率估计在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g组织 ） 存在的普遍问题： 蛋白提取率低 ，尚无法满足临床需要 解决： 更改其中的试剂或步骤： 去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用MonoQ或POROS20QE柱 增加组织中gP96含量： 热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入gP96cDNA重组真核表达质粒以增加细胞中gP96合成量 gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗的实验研究 北京大学人民医院胸部微创中心胸外科 博士研究生： 李运 导 师： 王俊 教授 研究背景 全世界肺癌病例 956例 1920年 374例 1912年 200例 1910年 160，400 178，100 1997年 157，200 171，900 2003年 154，900 169，400 2002年 肺癌死亡病例 新增肺癌病例 （美国） 发病占全部肿瘤发生的15%，死亡占全部因肿瘤死亡病例的29% 整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15% 肿瘤抗原 免疫系统 特异性抗原识别 破坏和消灭肿瘤细胞 抗原呈递系统 HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全部抗原肽具有该细胞特有的抗原库的作用, 称为“分子伴侣” 抗原 gP96 经典的外源性抗原呈递途径 gP96介导的外源性抗原呈递途径 通过MHC-II类分子激活CD4+T淋巴细胞 通过MHC-I类分子激活CD8+T淋巴细胞 途径 激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能 树突状细胞体内最强的抗原呈递细胞 + gP96 or DC 科研工作新问题 单方面要素 两方面要素 gP96 多价性 特异性 （抗原库） DC 识别抗原 激活细胞免疫 （专职抗原 呈递细胞） 研究内容 肺癌组织提取gP96 SDS—PAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析 蛋白定量分析 RT-PCR检测RNA水平表达 免疫组化检测蛋白水平表达 第一部分 gp96多肽复合物提取鉴定 在肺癌组织中表达的研究 肺癌组织gP96提取和鉴定； 肺癌组织和正常组织gP96的表达水平； [目的] [流程] 定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1μg/ul左右，相当于50-80ug/g组织。 肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集 正常肺组织中细胞苏木素染色阴性 同一患者标本 0.001 -4.318 1.110±0.4467 0.6725±0.4713 gp96 p value t value T (x±s) N (x±s) Gene 外周血单个核细胞提取及体外扩增 流式细胞仪鉴定 gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗 体外CTL反应，INF-γ浓度 淋巴细胞表型分析 第二部分 gP96多肽复合物/DC疫苗体外 诱导CTL反应实验研究 外周血来源DC培养和鉴定 gP96多肽复合物/DC疫苗的制备 gP96/DC体外实验 [目的] [流程] 培养2-3天后的DC 培养7天后的DC A-1．培养前CD1a- A-2. 培养后CD1a+ B-1. 培养前CD86- B-2. 培养后CD86+ C-1. 培养前CD83- C-2. 培养后CD83+ D-1. 培养前CD80- D-2. 培养后CD80+ E-1. 培养前CD14+ E-2. 培养后CD14- CD14-；CD80+；CD83+；CD86+ 培养前淋巴细胞的CD3 培养10d后淋巴细胞的CD3 培养前淋巴细胞的CD4、CD8 培养10d淋巴细胞的CD4、CD8 CD3/CD8＋T细胞明显增加；CD8＋/CD4＋细胞比例增加 122.966 0.126±0.011 DC 3066.847 1.674±0.162 gp96 4150.835 2.244±0.133 gp96/DC 释放IFN-γ的量（pg/ml） ELISA反应的OD值(X±S) 样本 建立动物模型 以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤 观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间 第三部分 gP96多肽复合物/DC疫苗 动物体内实验研究 gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究 [目的] [流程] LA795肺癌肿瘤组织 提取Gp96 小鼠外周血 615小鼠肺癌模型 Gp96/DC，Gp96，DC 提取DC细