第章 生物素亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用.pptx

临床免疫学检验技术 ; 肖建华;; ;概 述; ;;一、生物素理化性质 ; ;生物素侧链末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物—活化生物素。;活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。 ;C;BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键。 BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质。;如何减小空间位阻;;2. 标记蛋白质醛基的活化生物素;3. 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) ：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素。 4. 标记核酸的活化生物素 (1)光敏生物素(photobiotin)： 侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后变为芳香基硝基苯，与腺嘌呤N-7位氨基结合，形成生物素化的核酸探针，用于DNA或RNA的标记。;(2)生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）：作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法通过DNaseⅠ和DNA聚合酶Ⅰ的作用而掺入到双链DNA中。 (3) BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4位氨基结合，形成生物素标记的核酸探针，但对碱基配对有影响。（不常用）;活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价； 可标记生物活性大分子，如抗原、抗体。BNHS多标记抗体，BHZ则多标记偏酸性抗原，标记后抗原、抗体活性不变； 可对示踪物标记，碱性磷酸酶标记后活性将降低。; 讲授内容;亲合素(avidin, A / AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。（实际应用中多用链霉亲合素） 二者均为大分子蛋白，目前所有用于标记的物质均可与亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。 能与生物活性分子抗原、抗体结合，也能与示踪物结合。多与酶、荧光素及胶体金偶联。;结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基 分子量 68 kD 65 kD pI 10.5 6 结合位 色氨酸 色氨酸 生物素 4 4 Ka 1015 1015 活性U 13～15 15～18;AV/SA耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结合后稳定性更好，每个亲和素能结合四个分子的生物素。;BAS-WB WB;四、适???性广;;生物素与亲合素之间的结合亲合力高、特异性强； 两者各自均可与各型大小分子结合，且二者的结合反应具有多级放大作用； 已广泛应用于各种标记免疫分析技术，BAS在免疫标记技术中既可用于检测系统的信号放大，又可用于固相载体的包被。;一、固相载体包被 固相吸附分离是非均相免疫分析重要的分离方法。引入生物素-亲合素（链霉亲合素）系统连接于固相载体表面，再与欲包被的抗原或抗体结合，实现间接包被，可极大地提高非均相免疫分析的敏感性。包被方法有： （一）生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(Ag)包被法 （二）链霉亲合素-生物素化抗体（或Ag）包被法;1.生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(或Ag)包被法;;链霉亲合素-生物素化抗体包被法(BA包被法)比生物素-链霉亲合素-生物素化抗体包被法(B-BAB包被法) 简便、高效、省时省材； BAS连接固相载体的包被模式，可增加抗体(或Ag)包被数量，减少空间位阻效应，提高检测的灵敏度和准确度； 链霉亲合素预包被磁性纳米微球可作为通用试剂，用于反应体系成分的分离、纯化及不同项目的检测，如发光免疫分析。;;;;;1. BAB法;; （一）生物素-亲合素-生物素模式;; BA 或LAB法;BAB法与BA法比较 BAB法：以游离亲和素为桥，分别连接生物素化抗体和生物素化酶。 BA法 ：以酶标AV/ SA代替BAB法中的游离亲和素，省却了加生物素化酶的步骤。 ;BSA在酶免疫测定中的应用 BSA在荧光免疫技术中的应用 BSA在放射免疫测定中的应用 BAS在化学发光免疫分析中的应用 BAS在胶体金免疫技术中的应用 BSA在分子生物学中的应用 BAS在其它方面的应用：分子和细胞的分离与纯化、肿瘤诊断与治疗、增强杂交细胞融合率等;;小 结;思 考 题;Thank you !