细胞实验四 阳离子脂质体的细胞转染.pptx

阳离子脂质体的细胞转染;;阳离子脂质体介导法;主要应用：瞬时转染、稳定转染 使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。 虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织中累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受到限制。;利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。;阳离子脂质体介导法——HilyMax;阳离子脂质体介导法——HilyMax;2、DNA-HilyMax复合体形成： （1）加入120μL无血清培养基至离心管； （2）加入2μg质粒DNA到以上离心管中，轻柔混匀； （3）加入1μLHilyMax转染试剂到以上中，轻柔混匀，HilyMax和DNA比例为1:2-1:7； （4）室温静置15min。 ;阳离子脂质体介导法——HilyMax;1、?细胞接种 为了获得更好的转染效率，细胞的接种密度建议为50%-60%。接种后放培养箱预培养24小时左右。 ·接种细胞前需调整好细胞状态，一般细胞在对数期活性最高。 ·接种密度请合理调整，以保证实验后期细胞的状态保持良好。 2、?HilyMax-DNA复合物的制备（以12孔板为例） ⑴ 2 ug质粒（以GFP为例）加入到60 ul无血清DMEM培养基中，混匀，静置5分钟。 ⑵ 2-4 ul HilyMax加入到另一管 60 ul无血清DMEM培养基中，混匀，静置5分钟。 ·转染试剂HilyMax每次使用前请注意重新混匀。 ·滴加HilyMax转染试剂时注意悬空操作，请勿接触离心管壁。 ·一般讲HilyMax稀释液加入到质粒稀释液中，请勿颠倒滴加顺序。 ⑶ 操作⑵的HilyMax稀释液滴加到⑴的质粒稀释液中，混匀，静置15分钟。 ·此步操作的静止时间一般为15分钟，尽量不要超过30分钟。 ⑷ 细胞培养板从培养箱中拿出，更换新鲜DMEM培养基，每孔500 ul为宜。 ⑸ 操作⑶的HilyMax与质粒的混合液滴加到细胞培养孔中，轻摇混匀。 ·做转染实验的培养板每孔培养基体积建议适当减少，例如12孔板加500 ul，以提高转染效率。 3、放入培养箱培养24小时左右，获取图像。 ;??验课PPT及结果 medcellular2015@ 密码：medcellular2015