植物组织培养技术任务二 培养基1.ppt

§5 灭菌技术 一、灭菌的几个概念 2、灭菌与消毒 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。 消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。 显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物， 但是，在通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。 在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 §5 灭菌技术 二、灭菌方法 常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两类： 物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施； 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 二、灭菌方法 1、干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱进行烘烤灭菌的方法。 适用于玻璃器皿及耐热器械的灭菌消毒。 由于在干热条件下，细菌营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌。 干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料或铝铂。 2、湿热灭菌 利用高压蒸汽灭菌的方法。 此法适用于培养基、蒸馏水、各种器械、棉塞等的灭菌。 将高压蒸汽灭菌锅的压力调至0.1MPa，锅内温度达121℃，维持20-30min，即可达到灭菌效果。 3、过滤灭菌 培养基配制过程中，如遇到某些化学物质，经高温高压而易于分解减效或失效的可以采用细菌过滤器进行过滤灭菌。 如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素等通常采用过滤灭菌方法。此法也适用于液体培养基和蒸馏水的灭菌。 过滤灭菌所使用的滤膜网孔的直径为0.2-0.45μm范围内。 在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。 二、灭菌方法 微孔滤膜 0.2μm/0.45 μm 4、烧灼灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。 用紫外线灯照射灭菌的方法。 适用于接种室空气、超净台或接种箱的消毒灭菌，在试管受精中可以用于花粉灭菌。 紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。 照射时间一般为15-20min。紫外线的波长为200-300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。 5、照射灭菌 利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。 这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。适用于接种室和培养室的灭菌。 通过加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。 如将甲醛置于广口容器中，加入高锰酸钾促进甲醛的快速挥发而起到熏蒸灭菌的作用。一般每米3用甲醛2mL、高锰酸钾1g。但是为了避免材料中毒死亡，对有培养材料的培养室可改用乙二醇加热熏蒸的方法，每米3用乙二醇6mL。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。 6、熏蒸灭菌 7、药剂灭菌 利用70%-75%酒精、0.1%-0.2%升汞（氯化汞）、10%的次氯酸钠、饱和漂白粉上清夜等药剂灭菌的方法。 适用于培养材料的表面灭菌。 化学消毒剂可以使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。 常用灭菌药剂的使用和效果 消毒剂 使用浓度/% 清除难易 消毒时间/min 灭菌效果 次氯酸钠 2 易 5-30 很好 次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好 漂白粉 饱和溶液 易 5-30 很好 升汞 0.1-0.2 较难 2-10 最好 酒精 70-75 易 0.2-2 好 过氧化氢 10-12 最易 5-15 好 溴水 1-2 易 2-10 很好 硝酸银 1 较难 5-30 好 抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好 §5 灭菌技术 三、具体操作 1.培养基灭菌 2.玻璃器皿灭菌 3.接种工具灭菌 4.实验服、口罩、滤纸灭菌 5.接种室灭菌 6.外植体灭菌 7.物体表面灭菌 8.培养室灭菌 9.无菌接种操作 §5 灭菌技术 三、具体操作 1.培养基灭菌 培养基灭菌是植物材料离体培养中十分重要的环节。 灭菌方法有高压蒸汽灭菌和过滤灭菌两种方法。 高压蒸汽灭菌法适用于固体培养基的灭菌。 过滤灭菌法适用于液体培养基的灭菌。 1.外桶 2.锅盖 3.安