3T3-L1诱导分化成熟脂肪细胞方案.doc

Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，0.22um过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX. 2、胰岛素溶液配制。比较难溶，-20℃保存1个月，使用PH 2~3的稀盐酸溶液助溶，0.22um过滤除菌。100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL。每毫升培养基加10ul胰岛素。 3、地塞米松溶液配制。分子量516.41，0.22um过滤除菌，-20℃保存1个月。使用无水乙醇溶解，1000×母液（1mmol/L）。1mg溶于25ml无水乙醇，每1ml加10ul。 二、3T3-LI细胞系的培养、诱导 1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中，37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养，2d换液一次。 2、3T3-Ll细胞系的诱导：细胞生长状态良好时实验。细胞传代分瓶，每一瓶中的细胞数约为1×105，每48h换液。当细胞接触抑制2d后，加入诱导剂 (10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液（含10ug/ml胰岛素，1umol/L地塞米松，0.5mmol/L IBMX），培养2d。然后换为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（含10ug/ml的胰岛 素），培养2d。改为10%的胎牛血清的DMEM培养液，每2d换液一直到诱导成为成熟的脂肪细胞(细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴)，占总体积的90%。 三、注意事项 1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。太早，细胞没有退出生长周期。太迟，细胞诱导后容易漂浮。 2、3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。将细胞冻存起来，使用时再复苏。 3、大约需要8~10天，可以诱导分化成功。之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。 4、诱导前后使用油红O染色鉴定。证明是成熟脂肪细胞，而不是空泡样变性。方法：油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔，室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。