Chapter2 细胞生物学研究方法.ppt

* * Lymphocyte viewed through a TEM and a SEM. (a) This TEM shows a thin slice of a lymphocyte, a type of white blood cell. This type of microscopy allows one to see the internal structures present in the slice. (b) In a SEM, surface structures can be seen ,as demonstrated in this view of a lymphocyte.Note the three-dimensional appearance of this cell,in contrast to the two-dimensional appearance of the cell in(a) * 2.1.5 电子显微镜的样品制备 ?与光镜相比，组织固定的特殊要求： 样品要薄，制成50～100nm的超薄切片。 保持样品的精细结构。 样品要具有一定的反差。 电子显微镜的样品切片最后被放置在载网上而不是玻片上。 * 染色(Stainning) 醋酸双氧铀： 可与细胞内大多数分子结合，染核酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。 柠檬酸铅：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细胞膜系统与物质的反差。 * 1.负染色(negative stainning) 用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。 * 2. 喷镀技术 是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。 * 3.冰冻蚀刻技术 * 电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM TEM 200nm 100nm 0.1nm 可见光（400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 玻璃透镜 石英透镜 电磁透镜 不要求真空 不要求真空 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 * 显微结构（microscopic structure）：光镜下所见到的物体结构。 超微结构（ultrastructure）:又称为亚显微结构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构。 * 2.2 细胞化学技术 ◆ 酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。 ◆ 免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。 免疫荧光技术 免疫电镜 * Figure 9-16. Indirect immuno-cytochemistry. This detection method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly used marker molecules include fluorescent dyes (for fluorescence microscopy), the enzyme horseradish peroxidase (for either conventional light microscopy or electron microscopy), colloidal gold spheres (for electron microscopy), and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase (for biochemical detection). * 过氧物酶体 过氧化氢酶 * 2.3 细胞分选技术(cell sorting) ◆细胞分选： 用流式细胞仪（flow cytometer， FCM）对细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。 * 细胞标记 * 流式细胞术 干涉 荧光 荧光