植物组织培养基本操作.ppt

第四节 外植体的培养 接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。 一、外植体的培养条件 1、光照 光照对植物生长发育有重要作用，是离体培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用日光灯作光源，光照强度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照12-16小时，也可每天光照16小时，8小时黑暗。 2、温度 离体培养中对温度的控制比光照更为重要，大所数植物最适温度在23-32℃之间。培养室温度是25±2℃。低于15℃时，培养的组织生长停顿，高于35℃对生长也不利。因此，培养室应安装空调机或其他的控温设备。 3、湿度 培养瓶内相对湿度通常是100%，而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。 4、氧气 离体培养的试管苗是需要氧气的，在固体培养或液体静置培养时，如果组织完全浸入培养基中，与氧气隔绝，就会停止生长。因此，接种时要有部分组织合空气接触。振荡培养是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。 二、外植体的成苗途径 外植体的成苗途径有三种： （一）外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种： 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。 2、愈伤组织-茎-根-植株。 3、愈伤组织-根-芽-植株。 （二）外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生： 1、器官上发生。 2、愈伤组织上发生。 3、游离单细胞发生。 4、小孢子发生。 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 （三）外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养 三、培养中常见问题 （一）污染的原因及其预防措施 1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类。 ⑴细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。 污染途径： 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 ⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径： 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大 2、污染的预防措施 ⑴防止材料带菌的措施 -茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。 -晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。 -接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。 （2）外植体的灭菌 -多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠 -多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水。 ⑶器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌 ⑷布质制品的灭菌 湿热灭菌 ⑸无菌操作室的灭菌 2%新捷尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。 ⑹严格按照操作程序。 （二）外植体的褐变及其防止措施。 1、褐变的原因 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。 ⑴基因型 某些植物酚类物质含量较多。 ⑵外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。 ⑶培养基的成分 -过高的无机盐浓度 -生长调节物质使用不当，BA过多 -分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制 -培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。 ⑷材料转移时间 时间过长引起材料褐变。 2、褐变的防止措施 ⑴选择适宜的外植体及最佳培养基。 ⑵连续转移。 ⑶加抗氧化物。 ⑷加活性炭。0.1-0.5%活性炭 （三）玻璃化现象及其预防措施 1、玻璃化现象及其产生原因 玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化，试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是： ⑴激素浓度 BA浓度提高，导致玻璃化苗的产生。 ⑵琼脂浓度 琼脂浓度低，玻璃化苗增加。 ⑶温度 低温易形成玻璃化苗。 ⑷光照时间 一般要求10-12h，大