实验六 牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察生命.ppt

1. 各物种染色体都具有特定的数目与形态特征。而且同一物种内的各染色体间往往也能够通过其形态特征加以区分、识别。 * * 10：松散的团装，类似于线团，染色比致密的细胞核颜色浅，背景清晰，杂质较少。 40：呈X型中期染色体，可以看清结构并数清其条数。 100：将最好的一个图像移至视野正中央，下降载物台，滴香柏油转油镜观察图像，拍照保存。 * Giemsa染料是由亚甲蓝，天蓝和伊红组成的复合染料，除伊红外，均为噻嗪类染料，它与DNA中的PO43-结合而不与蛋白质结合。 其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。染色体上高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻嗪-伊红沉淀物的形成，经一系列处理后显示暗带，而另一些区域则为的亲水性蛋白质，对染料亲和力低，所以不显色。 Giemsa显色原理： 染色体上与DNA结合疏松的组蛋白被胰酶分解，这些区域富含GC，染色浅；而组蛋白与DNA结合牢固的区段则被染成深色，这些区域富含AT。 有学者认为：相差显微镜观察未染色的染色体时，能直接观察到带的存在，说明显带现象是染色体本身具有的结构决定的。 动物的骨髓中存在大量活跃的进行有丝分裂的细胞，是染色体制备的理想材料。 给动物注射特异作用于微管蛋白的秋水仙素后，可以抑制纺锤体的形成，使分裂细胞阻断于有丝分裂中期。 收集骨髓细胞，低渗处理，使细胞质膜破裂，以利染色体的分散。 细胞经固定后，于预冷的载玻片上滴片，使染色体散开，再用姬姆萨染色，便可以制成染色体标本。 小结本实验简要原理： 三、实验用品 试剂：0.65％生理盐水，甲醇—冰醋酸(3:1)固定液, 蒸馏水，Giemsa染液，水。 器材：显微镜，搪瓷盘，剪刀，烧杯，小离心管，玻璃注射器，染色缸，离心机，一次性手套，骨剪（实验班公用）。 材料：成体牛蛙 四、动物的药物处理 牛蛙称重，按每克体重2微克的剂量腹腔注射秋水仙素溶液(用0.65％生理盐水配制)。注射后3.5~4小时，用过量乙醚或氯仿麻醉牛蛙。 五、实验步骤 每2个小组合为1个大组， 请1名同学取1只牛蛙。 上肢1 下肢2 腹部向上，从两个后肢之间开始剪 取后肢：剪开牛蛙后肢与尾椎接合部的肌肉，可看到膨大的关节部。 取后肢2：用剪刀顺着关节外围剪开。 取后肢3：剪开后的后腿关节。 取前肢1：找到关节所在。 取前肢2：剪开肌肉，顺着关节外围剪开。 1. 每组同学取前肢、后肢各一，剔除肌肉和结缔组织等，获得3根长骨。 2. 用骨剪（使用骨剪时要小心，不要剪到硬骨部分损坏骨剪韧口），剪去骨两端膨大部的半透明软骨，程度以刚刚露出骨髓组织为宜。 3. 小烧杯中加6ml0.65％生理盐水，取带针头的玻璃注射器，吸入2ml 0.65％生理盐水，将针头沿骨的长轴方向从骨的一端刺入骨中，缓慢推动注射器活塞，将骨髓细胞冲洗到小烧杯中。此6ml的生理盐水要反复使用，直到把所有材料中的骨髓冲出为止。 及时将大块白色脂肪组织用镊子挑出，弃去，否则容易堵塞注射器。 注意：冲洗时动作要徐缓，以免溶液喷出，损失骨髓细胞。 把6ml的骨髓细胞悬液转移至4只1.5ml离心管中（每管1.2ml，如体积不满，可再加入适量生理盐水，以保证离心平衡），3000转/分，5分钟。 小心吸去上清液（弃去）。向每一离心管中加入75 μl的0.65％生理盐水，用吹打的方法将沉淀物充分悬浮。 合并4管悬浮液，均分为2管，每管150μl细胞悬液 ，以后操作每组的两人各做一份。 低渗的时间和温度必须控制好！低渗不足，则染色体聚在一起。过度，则造成细胞破碎，染色体丢失。 每管细胞悬液中加蒸馏水lml，吹打混匀，30度孵育箱中静置，低渗处理20分钟。 低渗处理是凭借反渗透作用使动物细胞充分吸水膨胀，染色体铺展分散，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。 徐道觉如何 发现低渗处理？ 将低渗处理后的细胞悬液3000转/分离心5分钟，小心吸去上清液（弃去），每管加入甲醇-冰醋酸固定液 lml，固定15分钟，用吹打法将细胞充分悬浮。 重复上面步骤一次。 3000转/分离心5分钟，小心吸去上清液（每管约900 μl弃去），留少量残液用吹打法将沉淀充分悬浮。 为什么要固定2次？ 防止离心时细胞间的相互黏连，对中期染色体的分散质量有一定帮助。 取细胞悬液20μl，从高处滴加到预冷的、酒精浸泡的载玻片上。 室温干燥载玻片。 每人做2片标本。 80cm左右 预先用水反复练习 载玻片从冰箱取出立即滴片。玻片干燥后应在一端用记号笔做标记，以免搞错正反面。 将干燥后的载玻片放入Giemsa染液染色20分钟，然后在水染色缸中浸一下，洗去浮色。 滤纸吸干载玻片底面和周围的水分，待干燥后在显微镜下