细胞培养和离心技术 课件.ppt

从组织中制备细胞核 细胞破碎：裂解缓冲液：0.25M蔗糖， 10mM Tris-HCl pH7.4, 10mM NaCl （低渗）, 3mM MgCl2, 1mM DTT, 0.5mM PMSF。 组织研磨器； 肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器 离心： 浓蔗糖溶液：2M蔗糖 组织匀浆产物和浓蔗糖溶液等体积混合 23 000g， 30min， 4°C(白色沉淀)，水平转头(SW) 6.举例:线粒体分离 原理： 线粒体特征：体积较大，沉降系数较大； 类似大小的细胞器较多，但密度有差别。 分离设计： 细胞破碎（机械匀浆） 差速离心，必要时密度梯度离心 （1）从大鼠肝脏组织中制备线粒体 细胞破碎：匀浆缓冲液（MS缓冲液，等渗） ：0.21M甘露糖 5mM Tris-HCl pH7.5, 70mM 蔗糖, 1mM EDTA Potter-Elvehjem或Dounce匀浆器/松型槌； 肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器 离心： 第一步：1300g， 10min， 4°C×3次， 沉淀未破碎细胞、细胞核、大片细胞膜和结缔组织纤维； 第二步：17 000g，15min, 4°C×2次， 沉淀线粒体。 （2）从培养细胞中制备线粒体 细胞破碎：匀浆缓冲液（低渗） ：10mM NaCl 10mM Tris-HCl pH7.5, 2.5mM MgCl2，细胞膨胀； Dounce匀浆器/紧型槌：数次 立刻加入MS等渗缓冲液，保持细胞器渗透压 离心： 第一步：1300g， 5min， 4°C×3次， 沉淀未破碎细胞、细胞核、大片细胞膜和结缔组织纤维； 第二步：17 000g，15min, 4°C×3次， 沉淀线粒体。 （3）密度梯度离心纯化线粒体 介质： Ficoll,Percoll,碘化介质（OptiPrep,Nycodenz,metrizamide),蔗糖 最常用的介质：非连续蔗糖梯度 1.5M蔗糖和1.0M蔗糖，10mMTris-HCl,pH7.5,1mM EDTA （3）密度梯度离心纯化线粒体 离心： 第一步：60 000g，20min， 4°C，水平转头(SW) 线粒体在1M蔗糖和1.5M蔗糖界面处分层，轻柔吸出，重悬在 稀释的蔗糖溶液中 第二步：17 000g，15min, 4°C， 沉淀线粒体。 亚细胞结构成分的离心分离技术 1.文献和成熟技术手册的参照 2.介质和离心方法的选择 3.离心机的选择和正确使用 * 离心机分类 制备型、分析型； 常温、低温； 台式、立式； 低速、高速、超速 低速：6800g(细胞级） 分离10000S的细胞及细胞器 如：Beckman公司的J6，GS-6 高速：17,700－50,400g（亚细胞级） 分离 100S的颗粒，包括部分细胞器及病毒, 如：Beckman公司的J2 超速：90,400－694,000g（分子级）离100S的颗粒, 如：Beckman公司的L,XL OptimaTM L-XP（Beckman Coulter) 制备型超速离心机 Max RPM 100000 Max Force (x g) 802400 性能指标： (1) 离心力：能达到的RCF； (2) 离心