细胞与遗传实验教学课件.ppt

注 意 1、无菌操作 2、胰蛋白酶消化时间要严格控制(镜下观察、时间长影响细胞贴壁) ( 温度、pH、浓度；0.02% EDTA---细胞成团时) 3、吹打细胞要适度 4、对于状态不好的细胞可分次消化。。。 5、影响细胞生长的因素：培养基（营养、激素、渗透压、pH值）、温度、气体、细胞接种密度、加入培养液的量、换液的掌握。。。 三、细胞计数 细胞的传代、冻存、生化研究及生长曲线制作等，都需对细胞进行计数。细胞的多少对实验结果会有影响。 仪 器 血球计数板 普通光学显微镜 材料和试剂 细胞株（PC12） 0.25%胰蛋白酶液（pH7.4） 10%小牛血清DMEM培养液 操 作 　单层细胞——胰蛋白酶液消化细胞 —— 弃胰酶——定量加入培养液（1-2ml）——轻轻吹打细胞（单细胞悬液）——取少许悬液计数细胞 　——根据传代所需细胞进行稀释。。。 计算公式 细胞数/毫升＝（４大格细胞数÷4 ）× 104 1ml＝1000mm3 每格体积=1×1×0.1 = 0.1mm3 =10-4 ml 注意：培养瓶中的细胞总数计算。。。 细胞计数示意图 PC12细胞分为分化型和未分化型，未分化为圆形，马血清可维持其未分化状态，而牛血清培养可使其自动分化。 注 意 细胞悬液吹打要适度，并尽量为单细胞悬液 正确使用计数板（不要压坏盖玻片） 悬液渗入计数室时，不易过多（溢出）、过少（气泡） 细胞有压线时，数左不数右、数上不数下 正确使用显微镜（电源、亮度、倍数、聚光器等） back 细胞与遗传实验 细胞培养 取活体动物组织，在体外，无菌条件下，模拟体内环境（营养、激素、渗透压、温度、pH值、气体），对其进行培养，使细胞能够生存、生长、繁殖并保持原来生物学特性的一种实验方法（原代、传代）。 细胞培养内容 细胞原代培养 细胞传代培养 细胞形态观察、活力测定 细胞计数 细胞生长曲线、分裂指数 细胞冻存与复苏 等等 无菌操作 无菌间及超净台消毒（紫外灯。。。。） 洗手 着装 试剂瓶等斜放（超净台中物品摆放次序。。。） 酒精棉消毒 近火焰操作 注意：不要将超净台中物品拿出。。。 一、活细胞观察 体外培养的、生长中的细胞，借助显微镜来进行察看、比较、判断，以求对细胞做出进一步处理（换液？传代 。。。） 器材 倒置显微镜 培养细胞株 方法 肉眼观察 显微镜下观察 肉眼观察 培养液清浊度（支原体、细菌、真菌。。。） 培养液颜色 显微镜下观察 细胞的密度 细胞的透明度（折光性。。。） 细胞的形状 L02细胞 (人正常肝细胞) --细胞呈梭型 贴壁生长 A549---人肺癌细胞（倒置显微镜 X10）------细胞呈梭形，有伪足，贴壁生长 PC-12---大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞---倒置显微镜 X10---细胞呈不规则形态，贴壁生长，生长速度快 人成骨肉瘤细胞Saos-2细胞--荧光显微镜40*--细胞多角形，贴壁良好 宫颈癌HeLa细胞 ---贴壁生长，呈多角形 B－NHL(非何杰金淋巴瘤细胞株)--荧光显微镜显微镜 X40；Hoechst 33258 染色---细胞呈圆形，成团生长 Molt4细胞--成人T淋巴细胞白血病细胞株--细胞呈葡聚状生长，悬浮细胞，聚集呈团，如单个散开分布示状态不好   二、细胞传代培养  细胞在支持物表面长满后，进行重新分配，再培养的过程。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。（悬浮型、贴壁型） 器材与试剂： 超净工作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 细胞株（PC12-大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞） 滴管、培养瓶、瓶塞等（无菌） 培养液：10%小牛血清DMEM（无菌） 消化液：0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）（无菌） 操 作(无菌) 细胞株——弃原培养液（可PBS 或 D-Hanks洗）——加胰旦白酶液（消化细胞）—— 弃胰旦白酶液（静置1-2 min。。。，倒置显微镜观察）——定量加入培养液1ml，冲打细胞成悬液（适度、打匀、尽量不要产生气泡）——取1滴细胞悬液进行细胞计数——按需接种至新培养瓶（皿） ——补足新鲜培养液（一传二，3ml/瓶）——37℃培养——观察细胞生长情况 0.5min 细胞传代消化法示意图 显微镜下细胞消化前后示意图