重组体导入受体细胞的原理与技术.ppt

电击法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。 6．电击法 （1）血影细胞：哺乳动物红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，形成仅被细胞膜包裹的细胞结构。 7．血影细胞介导法 （2）原理： 在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的同时，外源DNA也容易进入。上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性 可先将外源DNA转入血影细胞，再将血影细胞与受体细胞融合，从而将外源DNA转入受体细胞 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 1. 转化率 2.感受态细胞的比例 吸收了外源基因的细胞数占转化处理的活细胞数的比例 三、转化率的评价指标 Thanks！ * 参考宋思扬《生物技术概论》（第二版）p47 ②毒性基因（vir） 位于T-DNA区的上游，其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移，这一个区域也称为致病区。 ③Con区 该区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因(tra)，这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。 结合转移基因的编码区 该区的基因能调控Ti质粒的自我复制，所以又称为复制起始区。 ④Ori区 （4）转化过程 目的基因插入到Ti衍生的载体上的T-DNA区→形成重组DNA →重组DNA转入含有Vir基因的农杆菌中→农杆菌侵染植物→植物伤口处细胞分泌酚类化合物→菌内Vir基因表达→含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中。 Vir基因表达 VirA蛋白激活VirG蛋白 VirG蛋白结合到Vir启动子特定区域，成为Vir基因转录的激活因子。 VirD基因编码一系列位点专一的RE， VirC和VirE决定宿主范围， VirB和VirD则用于合成介导T-DNA转移的装置，将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中。 daoci 随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。 2．植物病毒介导的感染 (1)植物细胞原生质体感染 以dsDNA病毒花椰菜花斑病毒(CaMV)基因组作为载体，去除致病性基因，换上外源基因体外包装成有感染力的病毒颗粒，感染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。 利用植物病毒载体转化植物细胞的战略： (2)植物组织感染→植物双生病毒为一ssDNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每个颗粒中含有一条不同的ssDNA。 其中，A链能单独在细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，是一种很有潜力的植物病毒载体。 利用植物病毒载体转化植物细胞的战略： 植物病毒所载有的外源基因易被排斥出来或被消灭掉，插入外源基因的病毒容易失去感染力及宿主范围狭窄等问题有待解决，至今还没有真正可使用的DNA病毒载体。植物病毒衍生的载体目前还未得到广泛应用，但是这一方面的研究仍是植物转化方面的一个重要领域。 利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金粉或钨粉等金属微粒加速，使之穿过植物细胞的细胞壁及细胞膜，进入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。 枪的威力为430 m / s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。 3．基因枪法 金属颗粒 将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200～600V／cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1～2周，即可再生出整株植物。 4．电击法 一般以原生质体为受体细胞。 所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物 5．原生质体融合 将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。 (1)适用范围：游离细胞、原生质体、分生组织和胚胎组织等。 6．显微注射法 借助显微注射仪，将外源基因直接注入细胞。 (2)固定细胞技术： 动物细胞贴壁生长，不需要固定细胞 植物细胞必须先固定细胞 后进行显微注射。 转化率高，可达60％以上，对受体细胞无药物毒害，利于转化细胞的生长发育。 但是操作繁琐耗时，工作效率低，需精细的操作技术和精密的仪器设备，难以进行大批量的转化工作。 (3)特点： 该法具有操作简便快捷、转化效率高、无宿主限制、能转化细胞器等优点，但需要昂贵的仪器和较高的技术要求，而且稳定性和安全性不如电击法和基因枪