流式细胞术的应用课件.pptx

三、流式细胞术的应用;生物学功能的应用;应用领域;3.1 检测细胞周期 3.2 检测细胞凋亡 3.3 检测细胞增殖 3.4 免疫细胞表型和功能检测 3.5 检测细胞因子 3.6 检测细胞吞噬功能 3.7 流式分选;定义：是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后，再到下一次分裂结束的这种周而复始的循环过程。 细胞周期包括有丝分裂期（M期）和分裂间期（G1，S和G2期）;DNA含量在细胞周期的体现;流式细胞术应用于细胞周期检测;核酸荧光染料;PI标记法;样品制备：乙醇固定法 ;1. 变异系数（Coefficient of Variation，CV） 细胞群体之间DNA含量的细微差别可能具有显著的生物学意义。 表示流式分析中DNA含量的分辨率或精确度。 通常由G0/G1峰的CV来反映 【%CV=（SD/mean）x 100】 一般CV越小，峰形越好，越尖锐。 能控制在5%左右精度足够，一般小于8%-10%认为可信。 2. DNA指数（DNA index，DI） DNA指数，指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均荧光强度与正常二倍体G0/G1峰的平均荧光强度（Mean） 之间的比值。 DI为1 意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9-1.1）。 高于或低于1表示细胞/组织中DNA含量异常,常称为DNA非整倍体。 3. 倍体（Ploidy） 原指染色体数目，流式中为描述总的DNA含量。 二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 二倍体：DI为0.85-1.15 四倍体：DI为1.9-2.1 多倍体：DI 2.1， 其余DI值均为非整倍体 ;PI标记法;结果解读;DNA倍体分析;细胞周期检测临床意义;Diploid: 46.75 % Dip G1: 97.54 % at 46.06 Dip G2: 0.58 % at 92.12 Dip S: 1.88 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.26 Aneuploid 1: 47.55 % An1 G1: 93.05 % at 49.83 An1 G2: 0.00 % at 99.67 An1 S: 6.95 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.13 DI: 1.08 Aneuploid 2: 5.70 % An2 G1: 94.97 % at 55.72 An2 G2: 5.03 % at 103.44 An2 S: 0.00 % G2/G1: 1.86 %CV: 4.52 DI: 1.21;肺癌（胸水） ;3.2 检测细胞凋亡;细胞凋亡流式检测方法;3.2.1 细胞膜变化检测 - Annexin V/PI双染法;PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。;;细胞膜透性核酸染料， 激发波长：488nm/633nm 应用：与PI染料共同标记可用于细胞凋亡检测 原理：荧光强度 活细胞＞凋亡细胞＞死细胞;3.2.2 线粒体损伤检测 - 线粒体膜电位检测法;数据分析： ;3.2.3 细胞核DNA的检测－凋亡峰的检测;3.2.4 DNA断裂片段的检测(TUNNEL法);TUNEL法检测凋亡原理;Fas-induced Apoptosis in Jurkat T Cells;3.3 检测细胞增殖;3.3.1 示踪染料标记法;PMA刺激小鼠的脾细胞增殖图;Figure 1: Example staining data from DC-T cell assay, (1) CFSE-labeled T cells incubated with DCs that were not co-cultured with antigen, (2) CFSE-labeled T cells incubated with DCs that had been previously co-cultured with whole protein antigen (Drug 1), (3) CFSE-labeled T cells incubated with DCs that had been previously co-cultured with control antigen (Tuberculin PPD).;T cell proliferation with activation marker;3.3.2 BrdU标记法;BrdU标记时同时加入DNA染料(PI, 7-AAD)，结果为一个典型的“马蹄形”峰，不仅能得到G0/G1期、S期和G2/M期的比例，还能比较不同细胞DNA合成能力的不同。;BrdU标记法检测细胞增殖的另一优