实验二 骨髓细胞染色体制片与观察.ppt

实验二、骨髓细胞染色体 制片与观察 一、实验目的 学习活体小鼠骨髓细胞染色体标本的制片技术； 观察小鼠有丝分裂中期的染色体数目、结构及其特征。 二、实验原理 骨髓存在于长骨（肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如骼骨）的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织。骨髓中存在造血多能干细胞，具有高度自我更新的能力（即有丝分裂），并能分化为各血细胞系统的祖细胞（如淋巴系干细胞、粒系干细胞）。 骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要进行必要的处理： 酵母液诱导增加分裂期的细胞数量； 秋水仙素使细胞处于有丝分裂中期； kcl溶液低渗使细胞膨胀； 甲醇和冰醋酸固定使染色体保持完好的形态。 三、实验用品 器材：解剖盘、解剖剪、镊子、白纱布、10ml离心管、滴管、5ml注射器、烧杯、载玻片、盖玻片、酒精灯、显微镜、离心机和恒温培养箱等。 试剂：干酵母粉、葡萄糖、无水甲醇、冰醋酸、氯化钾、0.9% 氯化钠、0.02﹪秋水仙素、Giemsa原液等。 材料：小鼠。 四、实验步骤 取材前28h背部注射10%的酵母液，每只0.4ml。 取材前3-4 h腹腔注射0.02﹪秋水仙素溶液(0.01 ml／g体重) 预处理 腹腔内注射秋水仙素3~4小时后，断头处死小鼠。 （注：6为肱骨，14即股骨） 取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失。 滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等组织清除干净。 取骨髓细胞：用剪刀剪开股骨的两端使骨髓露出。用注射器抽取3 ml生理盐水，从一头插入骨髓腔缓慢冲洗，冲洗液接入10ml离心管内，洗至骨髓腔变灰白色。低渗：1000 r／min离心7 min后弃掉上清液，留下的细胞加人0.075 mol／L KCl低渗液6 ml，用吸管将骨髓细胞吹打成细胞悬液，37℃恒温水浴锅中低渗30 min。 预固定：加入新配制固定液(甲醇:冰醋酸 3:1) 5-6滴，轻轻打匀，室温下预固定5 min。固定：1000 r／min离心7 min，弃上清液，留细胞；加入4 ml新鲜固定液，轻轻打匀，室温下固定25 min；离心(条件同上)后弃上清留细胞。此步骤反复2次（时间紧张可只做一次）。滴片：视末次离心后获得细胞的多少留固定液0.2-0.4 ml。用细头滴管轻轻打匀。取冰浴中的载玻片一张，甩掉载玻片上的冰水后，迅速用吸管吸取细胞悬液，从35-40cm的高度滴到载玻片上，每张载片滴2-3滴，滴面不要重复，立即用嘴向一个方向轻轻吹开，使细胞染色体散开，但避免将细胞吹到一端。在酒精灯上过火2-3次，自然干燥备用。每只动物滴3-5张标本。 预冷的玻片 染色：将玻片平放于桌上，用吉姆萨使用液染色15-20 分钟后，用蒸馏水或自来水小心冲去染液，吸干后镜检。 结果显示 05级生物技术，40倍物镜 05级生物技术，100倍物镜 12拔尖班-赵堃 实验报告 绘图表示动物染色体的典型形态。 说明在小鼠骨髓染色体的制备过程中的关键步骤。