实验四小鼠脾脏单个核细胞的分离.ppt

实验四：小鼠脾脏单个核细胞的分离 免疫细胞分离方法： 根据不同免疫细胞表面标志: MACS，FACS 根据细胞理化性质： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感 基本概念 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。 以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 MACS 流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter, FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。??? 密度梯度离心法 离心后 血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形态，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环注入脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。 解剖图 胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越小，胸腺体积相对越大。 取脾脏 （一）取小鼠脾脏?（3人1组） 小鼠颈椎脱位处死 用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 实验步骤 1 2 3 4 6 5 7 8 9 10 超净台下操作全过程 可重复滤过 （二）制备单个核细胞悬液： 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min； 弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。 取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释） 以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度 注：1.减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 2. 计数完成后分两小组往下做，一小组做活力测定，一个小组做流式标记 实验步骤 塑料漏皿 （三）计算细胞浓度 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 计算细胞总数： 细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数。 实验步骤 计数时需要遵循一定的方向逐格进行以免重复或遗漏，对压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则。 （四）计算细胞活力 1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀； 2. 显微镜下观察： 如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细胞无反光，则为死细胞；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞； 3. 计算细胞活力：计数100个细胞中活细胞的百分率，一般活力应在95%以上。 死细胞 活细胞 自动化细胞计数器Luna? 韩国Logos Biosystems公司 在5×104 – 1×107 细胞/ml的浓度范围 3-60 μm的细胞直径范围内 一块计数板/2组 注意事项 通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他细胞。 Control 50ul PBS+ 0.5ul Ab 预实验结果 PE-CD19 B cells APC-CD3 T cells 50ul PBS+ 2ul Ab 分析数据时建议只放一组实验组，各人可自行安排 实验二报告分析 共性问题：