实验三 细胞吞噬及ACP染色.pptx

细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法） ;一、实验目的;二、实验原理 ;吞噬细胞是机体天然抵抗力的一个重要组成部分，也是特异性免疫不可缺少的一部分。测定机体吞噬细胞的功能，对了解机体免疫功能具有相当重要的意义。 单细胞动物通过细胞吞噬作用摄取营养物质，这也是一种原始的防御方式； 高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和中心粒细胞等也具有吞噬功能，广泛分布在组织和血液中，共同防御微生物的侵入、消除衰老和死亡细胞等。;吞噬细胞分类;巨噬细胞是由骨髓干细胞分化而成的，后进入血液达到组织（结缔组织及小血管的基底 膜组织）中并进一步分化成为各种巨噬细胞。 在机体的免疫过程中，巨噬细胞承担重要作用 固有免疫——非特异性吞噬：噬菌、杀菌、清除体内被损伤和衰老的细胞 获得性免疫——细胞免疫-抗原提呈：将捕获的抗原进行加工处理后，将信息传递给T、B淋巴细胞。 调节作用——巨噬细胞是天然杀伤细胞（NK细胞）的激活剂，且对淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。 巨噬细胞吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的高低。;细胞内外物质运输;细胞吞噬过程;静息的巨噬细胞分泌和杀伤功能低下，受到病原微生物或炎症因子的刺激时，巨噬细胞成为激发或致敏状态，分泌能力得以增强，但杀伤功能仍然很低。只有活化的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力，具有非特异抗感染和抗肿瘤作用。 常见巨噬细胞吞噬实验流程：;巨噬细胞吞噬鸡血细胞;吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。 吞噬作用是很多原生动物摄取营养的方式之一，原生动物门是动物界重最低等的一类真核单细胞动物，个体由单个细胞组成。通过鞭毛、纤毛或者伪足进行吞噬营养物质。 四膜虫的吞噬活动活跃且吞噬泡易于分离，是一个研究吞噬作用的良好模型。;溶酶体是普遍存在于所有动物细胞（哺乳动物的成熟红细胞除外）中的细胞器，在不同类型及不同功能的细胞内，溶酶体的数量及分布不同。 ;溶酶体是细胞中一种单位膜包围的异质性细胞器（在不同细胞甚至同种细胞中，形态大小差异较大），来自高尔基体，呈小球状；直径0.25~1μm不等。 溶酶体含有核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶六大类60多种酸性水解酶，有质子泵，以维持酸性的内环境，最适pH在5.0左右。 其中，酸性磷酸酶是溶酶体的标志性酶。;溶酶体的发现;溶酶体的类型;次级溶酶体;;细胞化学技术（cytochemistry） ——是在保持细胞结构完整的情况下，借助细胞中的化学反应在原位确定细胞中的细胞器或大分子的分布及这些成分在细胞中的动态变化等的技术。;酶是生物催化剂。酶有高度的特异性，它仅作用于一种或一类底物。因而，将酶催化其底物形成的最终产物显示出来，也就间接地显示了酶。 酶细胞化学是利用细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。在一定条件下酶进行催化产生一种可见产物，沉淀于原位，最终被光镜或电镜识别，以此来研究酶在组织细胞内的定位及其活性变化。;影响酶活性因素;酶细胞化学实验结果分析;ACP染色;溶酶体含多种酸性水解酶，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是溶酶体的标志性酶。利用酸性磷酸酶与底物反应后形成的棕黑色沉淀，可以显示溶酶体的分布。 在溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性。经固定，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，在合适pH条件下，酶活力被显示。 ;酸性磷酸酶在pH4.5~5.5时起作用，分解β-甘油磷酸释放出磷酸基团，磷酸与铅离子结合生成无色的磷酸盐沉淀，磷酸盐再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀，从而显示出酸性磷酸酶所在的位置。 β-甘油磷酸钠? 甘油 + PO43 - 2PO43 – +3Pb(NO3)2? Pb3(PO4)2 ?+6NO3 - Pb3(PO4)2 + 3(NH4)2S? 3PbS ? （棕黑色）+2(NH4)3PO4 ;;;每人 复式双筒显微镜（带油镜）、Motic数码互动系统 每组 常备：擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头； 香 柏油/二甲苯；（如缺少可至准备处补充） 实验材料：四膜虫培养液（200μl）； 0.1%油烟墨汁（100μl）； 2%豆奶液（100μl）； 试剂：10%甲醛溶液； 酸性磷酸酶作用液； 0.2%硫化铵水溶液（现用现配）； 蒸馏水 亮绿（两组公用） 整个实验班 高速离心机2台；温箱1台（32 ℃ ）；水浴锅2台（37 ℃ ）；烘箱1台（100 ℃ ） ;四、实验内容;四膜虫呼吸