植物原生质体的制备及融合.ppt

植物原生质体的制备及融合 背景 原生质体分离 细胞融合 病毒诱导融合（动物细胞） PEG诱导融合 电融合 背景 融合过程 细胞的接触 细胞质膜的融合 细胞质的融合 遗传物质的选择（异核体的核融合） 应用 杂交育种 单克隆抗体技术 实验器材、试剂等 材料 剑兰（唐菖蒲）花瓣 器材 显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊等 试剂 洗涤液 混合酶液 PEG溶液 高钙高pH溶液 20%蔗糖溶液等 原生质体的分离制备 取新鲜花瓣，以蒸馏水清洗，用吸水纸吸干多余水分。 用尖头镊剥取材料的下表皮（带有红色的叶肉细胞），将下表皮创面朝下浸在酶液中，27℃酶解1hr（振荡）。 原生质体的分离制备 镜检，反复吹吸，以获得更多游离的原生质体。 50 μm 50 μm 原生质体的分离制备 过滤，以去除大块组织。 700rpm离心5分钟，弃上清。 加入3mL洗涤液吹打均匀，700rpm离心5分钟，弃上清。 加入少量洗涤液（一两百微升即可或由原生质体的量来决定），悬浮原生质体。 镜检，如果碎片较多，可采取蔗糖漂浮方法去除碎片。 注意：随时镜检；离心管的配平 蔗糖漂浮 将原生质体悬液量补加至1mL 沿离心管壁将针头伸入到离心管底部，缓缓加入等体积的20%蔗糖溶液 700rpm离心5分钟。 将上层的洗涤液、下层的蔗糖溶液及细胞碎片吸出 镜检观察 注意：动作要轻缓，不能搅乱原生质体悬液与蔗糖溶液之间的界面 蔗糖漂浮前 蔗糖漂浮后 PEG融合 取一干净小平皿，滴一滴原生质体悬液，静置，使原生质体沉降。注意观察原生质体的形态。 缓缓滴加一滴PEG溶液，转动平皿使其混匀，静置观察。 滴加高钙高pH洗液，使其混匀，静置观察。 对照：只滴加PEG溶液 只滴加高钙高pH洗液 观察 细胞融合过程 实验报告 绘制细胞融合过程图 比较分析实验组与对照组之间的差异及原因 思考：原生质体制备和融合过程中各种试剂的渗透压？ 提醒 蔗糖漂浮 务必留下足够进行融合的细胞悬液 使用5ml离心管 配平 35mm dish用于酶解，60mm dish用于融合观察 整理 显微镜摆放整齐，注意“还原” 离心机使用结束后关闭电源 所用小平皿、离心管、漏斗、小镊子等自来水冲洗并以蒸馏水洗干净后，控干 托盘及其中的其他物品用自来水冲洗干净 实验中