流式细胞仪技术专题课件.ppt

其它分析 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 设门分析技术：Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 双色荧光散点图 荧光产生过程 Propidium Iodide 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm PI DNA Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorescein (FITC) 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Wavelength Protein Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Phycoerytherin (PE) Protein Allophycocyanin (APC) Protein 632.5 nm (HeNe) Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 基本操作 单细胞标本的制备（关键步骤） 外周血单细胞悬液制备 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。 培养细胞的单细胞悬液制备 基本操作 脱落细胞的单细胞悬液制备： 应去除取材伴随的杂质后再制备细胞悬液。 新鲜实体组织单细胞悬液制备： 常用方法：酶消化法、机械法、化学处理法、表面活性剂处理法等。 不论哪种方法都不可避免会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能造成不同程度的损伤。 活检标本单细胞悬液制备： 方法：与新鲜实体组织基本相同，要求镜检 取材标本至少取3块以上。 基本操作 石蜡包埋组织单细胞悬液制备： 常用方法：二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法、甲氧-双氧水处理法。 扩大了流式的应用范围，有利于进行临床回顾性研究。 评判单细胞悬液制备的标准： 细胞团块、碎片尽可能少，不能出现肉眼可见的团块，上机前细胞必须过300目滤膜。 细胞呈单个分散状态；细胞浓度：5×105~1×106 ；分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证下一步的荧光染色处理。 基本操作 标记荧光抗体： 直接免疫荧光染色：细胞与抗体反应，多用于细胞 表面标志的染色分析。 间接免疫荧光染色：先用一抗与待测抗原反应，再用二抗（荧光素标记）进行标记。 选择合适的荧光染料： 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发；激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围；荧光素光谱的重叠应当尽量减少。 影响荧光染色效果的因素 温度：高温时荧光淬灭的可能性增大。 pH值：其改变会导致荧光光谱改变，影响荧光强度。 固定剂：与细胞的某些物质结合后，干扰荧光染料与细胞成分的结合，造成荧光强度改变。 其他：孵育时间、溶剂的性质、细胞浓度等。 流式细胞术的细胞学应用 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡 在上述信号基础上的细胞分选 流式细胞仪的临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 流式细胞仪的科研应用 免疫功能研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 动物性别筛选 海洋与环境微生物分析 染色体分选 流式细胞仪的遗传学应用 细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 报告基因的定性定量检测 植物遗传学研究 ?????? 细胞增殖（细胞周期） 细胞内DNA含量 增殖相关基因的表达 BrdU的结合 示踪染料 DNA 探针 DNA探针最主要的特点是，它们与DNA含量是成化学正比关系的——这样，带有的探针荧光分子的