乳鼠肾细胞的原代培养1.ppt

原代培养 细胞体外生存过程 原代培养期 传代期 衰退期 细胞分离技术 离心分离法 机械分离法 化学分散法 细胞表面抗原（电泳、流式细胞仪）等 培养细胞的纯化 自然纯化 人工纯化 酶消化法 反复贴壁法 机械刮除法 克隆法 培养基限定法 流式细胞仪 细胞冻存与复苏 基本原则：慢冻快融 冻存 冻存保护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO） 复苏 37℃水浴中，30秒-1分钟，充分摇动使其急速融化。 活性检测 染色排除法 MTT比色法 乳鼠肾细胞的原代培养 实验器材与试剂 器材 超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器 酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离心管等 试剂 PBS溶液 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA溶液 DMEM培养基（含10%FBS及双抗） 实验方法与步骤（一） 将乳鼠（3天左右）断头放血致死。 进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。 实验方法与步骤（二） 用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪。 纵向将肾脏剪开，除去肾盂。将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。 吸去PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀）。 加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液，于37℃消化15～20分钟，直至组织块变白、呈疏松状（镜检可见分散的细胞） 加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，反复“吹打”分散细胞 去除大块组织后，1 000rpm离心10min；弃上清 加入PBS溶液重复洗涤、离心一次 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取少量细胞悬液（20uL） ，以PBS溶液稀释后进行计数 将细胞悬液按比例稀释后，分装至10mL培养瓶中（每瓶1.5 mL，每瓶80 ～100万细胞）， 37℃、5% CO2培养 1 ～ 2日后，观察细胞生长状况，并更换部分或全部培养液 细胞生长成单层后，即可进行传代 消化法 消化结果 将组织小块（约1mm3）均匀摆放在培养瓶壁上，平均间隔0.5cm 翻转培养瓶，加入1mL 含血清DMEM细胞培养液 瓶口部稍向上倾斜，置于二氧化碳培养箱中（37℃、5% CO2 ） 2hr后，将培养瓶轻轻翻转，继续培养 72hr后可以观察到生长晕，继续培养3 ～ 5日，更换部分或全部培养液 待生长晕相连后，去掉组织块，继续培养3 ～ 4日，即可进行传代培养 组织块法 生长晕 吸弃原培养基，以PBS溶液洗细胞1 ～ 2次； 加入200uL消化液，37 ℃消化3 min； 加500uL含10％血清的DMEM培养基终止消化； 1 000rpm，离心5min； 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞； 按比例分盘， 37oC、5％CO2培养； 观察记录细胞生长状况。 肾细胞的传代 整理 实验前后，用酒精棉球将超净台台面擦干净。 取肾后，请及时将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。 蜡盘、大头针用洗干净后，浸泡于酒精中。 小剪刀、小镊子在超净台中，可放置在专用的器械缸中；用毕洗干净，按规定放置（216，盆中）。 消化用小皿，用毕丢弃。 实验结束将废物缸中的物品丢弃，将废物缸洗净、控干水分，以酒精喷拭后置于超净台中。 试剂放回冰箱冷藏室中。 实验结束，将酒精灯中的酒精填至三分之二处。