Confocal原理 应用共聚焦激光扫描显微镜.ppt

8 Immunocytochemical methods The second antibodies can be labeled (marked)with either gold particles (for TEM) or fluorescent dye 多光子激光扫描显微镜 双光子激发现象 (two-photon excitation , TPE) 1931 年,Maria Gêppert - Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中,同时吸收两个光子而成激发态,这种情况就是双光子激发过 1961 年, Kaiser 等在CaF2 ∶Eu2 + 晶体中首次观察到了这种双光子激发现象. 350nm 700nm 450nm 450nm 对于双光子激发而言,只有在焦点处的微小区域内样品才能吸收足够的双光子而发出荧光. 将双光子激发的这一特点应用到CLSM 而产生的TPLSM ,可以获得比单光子CLSM 更清晰的三维荧光图像. 多光子激光扫描显微镜TPLSM) Multi-photon microscopy takes live cell experiments a decisive step further – by enabling penetration deep into a living tissue without applying damaging laser power levels. 双光子吸收仅局域于物镜焦点处的空间体积～λ3 的小范围内,使人们可以或甚至不使用共焦小孔,就能得到高清晰的三维图像,使显微镜的设计大为简化,易于操作. 减小非目标区域的光漂白 NADH 酶在350nm 的光激发下产生450nm的荧光, 这种350nm波长的紫外光对生物组织常常是有害的 而且紫外激光器相当昂贵。 而在双光子激发情形,NADH 酶则需同时吸收两个700nm 的光子才能产生450nm 的荧光. 双光子技术可以使我们无需使用紫外光源，而且避免紫外光对样品的伤害， 低能光子的能量只有在焦面处才增强到能够激发出荧光，因此大大减小了光束所经过的细胞或组织部分的光漂白现象，使被检测细胞所受的光损伤大大减小，从而延长了对活体的观察时间。 延长对活体生物样品的观察时间,为研究氨基酸、蛋白质等提供条件. 红外激光具有相对较深的传播距离,使得双光子激发共焦激光扫描荧光显微镜可对浑浊的样品表面以下较深( 200μm) 处进行成像观察. 多光子激光扫描显微镜的荧光波长远离激发光波长, 因此多光子显微镜可实现暗场成像。 另外,在此基础上发展起来的三光子激发(荧光分子同时吸收3 个光子) 的LSM,具有比TPLSM 更高的空间分辨率 Abusing confocal microscope Wrongly setup of laser intensity, PMT gain and offset and emission signal collecting range of the PMT can greatly influence the specificity, intensity of the final result. In the worst case, they even lead to false positive, false co-localization, or false negative results To make right setting for these parameters, whenever possible, prepare single labeled positive and negative control for each fluorophore you are using, stain control slides together with experiment slides to ensure they have same staining condition and similar intensity. Then use control slide to set proper PMT gain, offset and collecting range. Another type of abusing confocal is the wrongly choosing of application. using confocal microscopy for a simple co-localization study where the spatial localization or tomography information of t