细胞培养技术与应用 新版1课件.ppt

HSC-T6真菌污染 3、支原体检测方法和处理 1）荧光技术检测:支原体含有DNA,能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合,可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体. 2）直接培养法: 实验室常用 3) 放射自显影检测: 4) DNA分子杂交: 3) 污染支原体的处理: 抗生素处理；共培养法;重新克隆法；过滤法。 4、病毒检测 1）CPE或集落的检测; 2）血细胞吸附试验; 3）鸡胚接种. （九）细胞冻存、复苏、运输 在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，能导致细胞内发生一系列变化，如电解质浓度升高、渗透压改变、脱水等，能引起细胞死亡。 向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在－130℃以下低温中能减少冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5℃～0℃后，细胞仍能生长，活力不受损害。 1、冻存： （1）原理 （2）注意事项： ①消化细胞不要过度 ②冻存液7：2：1或4：5：1 DMSO为 无色纯品，变黄勿用。 ③温度：要逐步降温 从4℃ 30m--20℃ 30m--- ④ 70℃ 1-2h,然后移入液氮罐内。 ⑤细胞：对数生长期旺盛的细胞 ⑥做好记录：名称、日期、数量（还有代数) 2.复苏 (1)将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min内融化。 (2) 无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液移至离心管中，补加10ml培养液，500～1000rpm低速离心5min，去上清（ DMSO 在常温下对细胞有毒，应在细胞复苏后尽量除去），用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37℃培养，次日更换一次培养液。待细胞生长至一定密度后即可传代。 ＃ 冻存要慢，复苏要快 (3)细胞能否顺利复苏，影响因素较多，如冻存时细胞的状态以及有无污染等。目前，有学者介绍还应注意一点，即 细胞溶解后，可缓慢加入10倍冻存液的应用液培养12－48h，再换液。目的是逐渐稀释细胞和保护剂，避免细胞膜内外渗透压变化过于迅速而使部分细胞死亡 3.细胞的运输 (1) 选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。 (2) 妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。 (3) 到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养，次日传代。 四、细胞培养的应用 应用领域： 1、测试药物的效应 2、杂交瘤技术中。 3、基因转导（Gene transfer) 4、组织工程中 5、胚胎干细胞的相关研究与应用 1、测试药物效应 适用于研究抗癌药物和致畸、致癌、致突变的药物。范围： 1）鉴定有潜在活性的化合药物 2）药物发挥毒性的作用机制 3）预测可能用于临床的有效的细胞毒性药物 4）多种化合物中筛选有效成分及活性范围 5）确定效应细胞类型 6）确定毒性范围 7）研究药物浓度与暴露时间的关系 2、基因转导方面应用 当一个基因被克隆后，检测它的性状和功能的方法就是将它再导入细胞内，观察它在细胞内的表达。 把基因导入细胞内，使外源基因整合到受体细胞基因组中，是研究基因表达，结构和功能的重要手段，培养细胞使基因转导最适宜的对象。 （1）基因转导分类 1.染色体转导:利用细胞融合或显微注射法把携带目的基因的染色体或染色体片断整合入受体细胞（或宿主细胞）的技术。 2.基因转导：把已克隆的基因或含有目的基因的DNA片断或序列转入受体细胞基因组的技术。分为基因转染（Gene Transfection）和转基因技术(Transgenic Technique)。 （2）基因转染的应用 把基因导入体外培养细胞中，观察目的基因在体外细胞中的表达。以体细胞为基因导入对象时，一般用培养细胞，也可用体内二倍体细胞。如用体内细胞，需先从体内取出细胞，导入基因后，再输回体内，该技术已成为基因治疗技术之一。 （3）基因转染的方法 ①磷酸钙沉淀法； ②DEAE葡聚糖法： ③原生质融合法： ④微量注射法： ⑤脂质体包被法 ⑥电穿孔法等 可根据试验目的的需要，选择合适的方法。 (4)转染方法 贴壁细胞 1)收获细胞, 约2x105细胞重悬于2ml完全培养基中,转种于35mm培养皿中(或六孔板). 2)37oc,5%CO2培养箱培养18-24h