蛋白质化学6-理化性质与分离分析.ppt

* 不连续系统 不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者为好。 不连续体系 最早由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计，由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 浓缩效应的原理 样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 （1）样品浓缩效应 （a）凝胶孔径不连续性 （b）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 在pH6.7的凝胶缓冲体系中： 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G (Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c）电位梯度的不连续性： （2）分子筛效应 （3）电荷效应 不连续系统浓缩效应示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子；B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。 结果处理 量出加样端距溴酚蓝前沿间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 相对迁移率mR= 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 测定蛋白质的分子量 等电聚焦 (Isoelectric focusing, IFE) 一种特殊的PAGE电泳法，在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。 蛋白质为两性电解质，所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 （等）电聚焦（IEF）： 双向电泳(Two-dimensional Electrophoresis, 2-DE) 先后结合等电聚焦和SDS-PAFE电泳的技术被称为双向电泳，能使得复杂蛋白质的混合物得到好的分辨。较其他单独使用的电泳分析方法的灵敏度更高。双向电泳能分开不同pI但分子量相同或相近的蛋白质，也能分开相近pI但不同分子量的蛋白质。 第一向在圆筒形凝胶进行等电聚焦。再将等电聚焦凝胶平放到平板SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，水平方向反映的是pI差距的电泳，垂直方向反映的是分子量差异的电泳。 E. coli’s Proteins O’Farrell的蛋白质双向电泳 银染结果 考马斯亮染色为蓝色 毛细管电泳 (Capillary Electrophoresis, CE) 又称高效毛细管电泳(HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行电泳分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988-1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内，由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，得到了迅速的发展。 “CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离