实验六动物细胞原代培养幻灯片.ppt

上次实验总结 实验六 动物细胞原代培养 1 实验目的 (1) 学习动物细胞原代培养的一般方法与步骤。 (2) 学习培养细胞的观察方法。 (3) 掌握无菌操作技术。 2 实验原理 细胞培养是把生物体内的细胞取出，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长，繁殖，借以观察研究细胞的各种生命现象。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求： 一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。 二是严格控制无菌条件。 细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）是指直接从有机体获取细胞立即进行培养。任何动物细胞的培养均需从原代细胞培养做起。动物很多组织的细胞，如动物的肾、肺、卵巢、精巢等组织的细胞较易培养，而神经细胞等较难培养。 传代培养（subculture）是指当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。 3 实验材料,仪器和试剂 3.1 实验材料： 孕鼠或新生乳鼠 孕鼠 新生乳鼠 3.2 实验仪器： 超净工作台，眼科剪，眼科镊，平养皿，试管，培养方瓶，滴管，橡皮头，橡皮塞，恒温箱，倒置显微镜。 超净工作台 倒置显微镜 高压蒸汽灭菌锅 CO2培养箱 3.3 实验药品和试剂 1640培养基；青霉素溶液100单位／mL； 0.25％胰酶溶液; Hanks液; 75％酒精 1640培养基 4 实验步骤 4.1 组织块的获取和细胞培养 ⑴ 取材：取新生乳鼠一只，浸入75％酒精中浸泡5秒钟左右，携入超净工作台内，置于消毒培养皿中，用Hanks液洗涤2次，再剖开胸腹腔，剪取黄豆大小的肺、肾、心、肝、皮肤等组织，分别置于无菌平皿中。 ⑵ 清洗：用含双抗的Hanks液洗涤二次，并剔除脂肪、血液等。 ⑶ 剪切：组织块移入无菌短试管或青霉素瓶中，用眼科剪将组织块剪成1 mm3大小的碎块，再用Hank‘s液洗涤2次，自然沉淀，弃去带血的上清液。 (以下视频由2009级周泉同学提供) ⑷ 消化：加入0.25％胰蛋白酶液0.2ml，消化5-10分钟，吸去消化液，用Hanks液洗一次；再用培养液洗一次。 ⑸ 接种：用吸管将组织块吸入方形培养瓶内，均匀分散于底壁上，将此面(有标本的面)朝上，加入2-3ml培养液，塞好瓶塞，做好标记，置37 ℃温箱中培养。 ⑹培养：4-5小时后将培养瓶翻转，使有标本的瓶底壁朝下，使培养液浸泡组织块，继续置37℃温箱中培养。 4.2 原代培养细胞的观察 组织块培养2-3天后开始，每天小心取出培养瓶置于倒置显微镜下进行观察，并拍照。 一般最先“长出”的是形态不规则的游走细胞，接着“长”出成纤维细胞或上皮细胞，后逐渐出现细胞分裂，细胞数量增多，在组织块周围形成较大生长晕，随之细胞生长较快。 可根据培养液颜色变化，补加和更换培养液。如细胞生长良好，约10-15天可长成致密单层，这时可进行传代培养。 5 实验数据的记录和分析 明视野下，拍照原代培养细胞及相应的组织块。 以前的实验结果