蛋白质化学第三章 蛋白质.ppt

2.蛋白质的两性解离和等电点 蛋白质等电点的应用 等电沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电沉淀技术。 电泳技术：在溶液pH值不等于等电点的条件下，蛋白质分子显电性，在直流电场中向其所带电荷相反的电极泳动。根据这一原理建立了将带电性质不同的蛋白质混合物，在直流电场中进行电泳分离的技术，称力蛋白电泳。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离制备、分析鉴定中常用的一种实验手段。 3.蛋白质的变性作用 在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的次级键断裂，二、三级空间结构被破坏，分子的紧密构象变成了松散的无序状态。天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。叫做蛋白质的变性作用。 注意：蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。 造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。 变性 复性 注意：并不是所有变性蛋白都可以复性的！ 变性蛋白质的性质 理化性质发生了变化，旋光性改变，粘度增加，光吸收性质增，强失去了结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应增强。 生化性质发生了变化，变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解。 生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要的明显标志之一。 4.蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀现象。这即所谓蛋白质沉淀作用。 蛋白质的沉淀性质的应用 盐溶与盐析： 在蛋白质溶液中加入中性盐（如NaCl、（NH4）2SO4等）时，可产生以下两种现象：在盐浓度很稀的范围内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解度亦随之增加，这种现象称盐溶。盐溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水的亲和力，促进蛋白质的溶解。 与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成沉淀析出，这种现象称为盐析。 盐析作用的发生机理很复杂，一般认为中性盐与水的亲和力大，又是强电解质，当一定高浓度的中性盐加到蛋白质溶液中时，一方面结合大量自由水，降低水分活度；一方面又夺取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质分子之间互相作用的机会，促其聚集絮结成沉淀析出。 利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质沉淀的方法叫做盐析沉淀法。 不同蛋白质表面电荷量不同，水化膜的厚度不一样，盐析所需要的中性盐浓度也不一样，一般而言，相对分子质量大的容易盐析，相对分子质量越小，所需盐浓度越高。根据这种性质，同一溶液中不同相对分子质量的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来，这种方法称为分级盐析。 等电点盐析沉淀：盐析与等电点结合沉淀效果更好。一般是先将蛋白质溶液的pH调至目的蛋白质的等电点。然后再加固体(NH4)2SO4或其饱和溶液，使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀析出。 有机溶剂沉淀： 水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，具有介电常数比较小，与水的亲和力大，能以任何比例与水相溶等特点。当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜，同时，还能降低水的介电常数，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。 与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的浓度也与蛋白质相对分子质量有关，相对分子质量大的要求浓度低，相对分子质量小的要求浓度高。不同相对分子质量的混合溶液，可以通过调节有机溶剂的浓度达到分级沉淀的目的。 等电点有机溶剂沉淀： 有机密剂沉淀法若与等电点结合，沉淀更易发生，而且彻底。先将提取液pH调至目的蛋白质的等电点、再加有机溶剂到所得要的浓度，蛋白质会很快沉淀析出。 注意：在对蛋白质的影响方面，与盐析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，因此，用这种方法进行操作时需要注意：（1）低温操作。 （2）有机溶剂与蛋日质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好。 失活沉淀： 重金属盐沉淀：当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）结合，生成不溶性盐类，沉淀析出。误服重金属盐的病人，大量口服牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，就是因为这些食物中的蛋白质与重金属离子形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出体外。达到解毒的目的。 生物碱试剂沉淀：当溶液的pH低于等电点时，蛋白质分产是阳离子形式存在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）作用。生成不溶性盐沉淀，并伴随发生蛋白质分子变性。实验室中常用这些试剂定