实验八 动物细胞传代培养生命生医.ppt

吸管口从培养液或胰酶中吸液时，从瓶口中间伸入，不要碰瓶口。从液面浅表处吸，不要深入。 操作时，双手不要从瓶口、皿口上面经过，应绕过取物。 胰酶消化，加入2~3ml完全培养基终止后，吸管吹打力量适中，吸取悬液，对着瓶底打出。反复不超过10次。 低速离心后，缓慢取出，尽量少晃动离心管。 沉淀中加入1ml完全培养基，吹匀。 吸取1/3体积悬液至原瓶中，加5ml完全培养基，继续培养。 细胞传代的第二天，外观细胞培养瓶，培养液清亮，无混浊的污染物。贴壁面呈现白色点状。 倒置显微镜观察细胞，无细菌等污染。 细胞应分布均匀，密度在30%~50%之间，大部分细胞贴壁铺展良好。少量细胞圆形悬浮，为有丝分裂期细胞。 六. 预期的实验结果 七. 实验报告 Introduction 简述细胞培养的概念和要求。介绍原代培养和传代培养及其应用。 Materials methods 用自己语言详细总结细胞传代培养实验流程。 Results 通过倒置显微镜的观察，描述自己的实验结果（细胞生长状态、密度、分散情况、有无污染等）。 Discussion 1. 分析细胞生长优劣的影响因素，若结果不理想，是何原因？如何改进？ 2. 实验操作过程中应注意哪些问题？ 3. 对该实验有何意见或建议？ Questions （1）在细胞培养的过程中，若细胞培养皿/瓶中出现污染，该如何操作或挽救？如何判断污染源？ （2）若给你一株从你未培养过的细胞株，你应该怎样做才能顺利的将该细胞株顺利传代培养？ References * * ≤≤ 3。培养用液 培养液 平衡盐溶液 消化液 抗生素液 培养液（基） (1) 天然培养基 血清、水解乳蛋白、组织提取液 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 新生牛血清（newborn calf serum，NCS） 成年牛血清、马血清、羊血清、兔血清等 Invitrogen co.（GIBCO) HyClone co. 经严格检验：无细菌、支原体、病毒和内毒素 批号不同，活性不同 反复冻融会影响活性，需要分装－20℃贮存 杭州四季青公司 水解乳蛋白是乳蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸。 特殊情况下，如需要避免完全培养基中未知因素对细胞的产生影响时使用。 胚胎浸出液主要成分是大分子蛋白和小分子氨基酸，如鸡胚浸出液。 （2）合成培养基 主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子等，有几十种可选择。 MEM培养基 Earle于1951年开发成功。仅含有12种氨基酸、8种维生素、谷氨酸、必须的无机盐，组成简单。 DMEM培养基 Dulbecco等在MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培养。 RPMI1640培养基 Moor等为小鼠白血病细胞培养而设计，经过RPMI1630、1634改良而成。组分简单，适合许多种类细胞的生长，使用广泛。 F12培养基 Ham等针对小鼠体细胞培养设计而成F7，经过F10于1963年改良而成。特点是适合进行单细胞分离培养，需要的血清量少，因此是无血清培养基的常用的基础培养基。 M199、109培养基 Morgam等于1950年研制成功，最初为鸡胚组织培养设计，是最早的合成培养基之一。有60多种成分，含有几乎所有的氨基酸以及维生素、生长激素、核酸衍生物等。109培养基是199型的改良型。 无菌 溶于L水，调节pH，过滤除菌 如GIBICO,DMEM高糖 pH偏碱性 pH偏酸性 合成培养基中含有谷胺酰胺，是合成蛋白质和核酸的重要原料。 谷胺酰胺在溶液中极不稳定，易降解。每2周补加一次。 有粉末和溶液两种。 合成培养基的优缺点： 加入5%~10%血清即成为完全培养基（complete medium） （3）无血清培养基 血清成分复杂，某些特殊实验时会干扰实验结果。 无血清培养基完全采用人工合成的化合物，在合成培养基中添加激素、生长因子、金属离子转移蛋白、细胞黏附蛋白、结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、微量元素等 缺点：成本高，针对性强 平衡盐溶液 PBS Hank’s---酚红（指示剂）： 酸性呈黄色，碱性呈紫红色 可高压灭菌 消化液 贴壁细胞传代