-细胞培养技术完整课件.pptx

细胞培养技术与生物安全柜使用细则： 生物安全柜需预约使用。跨台使用需征得对方台人员同意，同台人员使用相互合作，消毒后顺延半小时还是无人到场工作，则应无条件让出工作台给同台其他人员使用，以免耽误他人实验。全外排生物安全柜20号、21号普通生物安全柜19号、22号 使用工作台时，应先用75%酒精棉球擦净台面，并将所需物品置于超净工作台内开启紫外线30分钟灭菌处理净化工作区积累的微生物。 每次使用完工作台后，应及时清除工作台面上的物品，并用75%酒精擦净台面使之始终保持洁净。废弃物分类倒入垃圾袋；废液倒入指定的塑料小桶内；注射器倒入锐器盒。二氧化碳培养箱使用说明：培养箱正常运作时电脑显示屏读数温度是37℃，CO2浓度是5%，低于阈值会报警。在此培养细胞的人员应每日或相隔一日前来检查细胞生长状况，若长时间不来以致细胞培养液干涸和细胞培养物出现污染，仪器负责人发现后有权清理出培养箱和作出丢弃处理。定期清洁培养箱，原则上以进入该室的时间先后和使用频率安排，请同学自觉配合。按培养箱门上登记位置放置细胞培养瓶，使用时注意箱内最底层盘里水不能干涸，以保持箱内湿度。发现箱内最底层盘里水少请去清洗房接纯水加入。Galaxy48R厌氧培养箱技术参数：温度设置范围：4oC-50oC?CO2浓围：0.2–20%CO2感应器：标配红外CO2感应器，自动调零功能，高温消毒过程中无需取出。 注意事项：开机前确保氮气瓶是有气状态。打开氮气前，确保减压阀处于最松位置（逆时针旋转至最高点，注意不要掉下来），连接好减压阀后，慢慢打开气阀，然后慢慢旋紧减压阀上面的开关，直至指针到0.3MPa。减压阀各个连接部位容易漏气，都打开好了之后，还要检查一下有没有漏气声。打开培养箱开关，培养箱有缓慢升温过程，在温度到达37℃后，才开始调节气体浓度。默认氧气浓度1%。 Countstar细胞计数仪主要参数：每次消耗20ul样本，计数时间20秒以内 500万像素摄像头 有聚团细胞校正功能注意事项:? 样本检测必须在样品注入测量槽10分钟内完成. 细胞样本推荐使用工作浓度0.2%的Trypan Blue染色原代培养的细胞, 建议用PBS或HANKS液清洗一遍后, 再用PBS或HANKS液重悬检测. 建议将原代细胞调到5×105-1×107/ml范围测量，以减少原代组织细胞碎片背景的干扰。Thermo MK3 酶标仪检测应用：可用于MTT、CCK8、蛋白浓度等常用吸光值检测。注意事项：设置各项参数：单波长测定选择Single ，双波长测定选择Dual选择Measurement Filter项确定测量滤光片波长选择Reference Filter项确定参比滤光片波长值本机目前配置的滤光片波长有5种：405nm、450nm、490nm、540nm、630nm、检查确认所设各参数无误，将酶标板放入仪器内（左上角为A1）关闭测量室的盖板（注意：不能将酶标板的盖子放入仪器内。）细胞污染来源支原体污染对细胞的影响： 个别严重情况下，加之细胞敏感，可使细胞增殖缓慢、部分细胞变圆、从瓶壁脱落。 但多数细胞受污染后，无明显变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。在观察不够细心和缺乏经验时，外观上往往给人以“正常”的感觉，实则污染细胞会受到多方面潜在的影响。? 支原体影响DNA合成，引起一系列严重后果，如改变细胞染色体核型、增加染色体畸变、抑制PHA促淋巴细胞转化等。 有的支原体还能与细胞竞争尿嘧啶，影响RNA的合成;能抑制细胞合成干扰素，降低细胞的抵抗力。 因此，在建立细胞系和进行各种实验研究时，首先应证明所用细胞有无支原体污染是十分重要的。1. 将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。2.3.首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗;用l:3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗;置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst?33258中染色10min;染色后用蒸溜水洗1-2min;向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察;镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。?对于支原体污染的细胞，可以采取补救措施：?1.抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24-48小时，再换入常规培养液，有时可能有效。推荐用量：庆大霉素200ug/ml?,四环素10ug/ml?，卡那霉素50ug/ml?。对于支原体污染抗生素应用，预防性应用比污染后使用好。?对于支原体污染的细胞，可以采取补救措施：2?、加温除菌： 根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体。但由于41度对培养细胞本身也有