第二章-海洋生物样品的采集与活性筛选方法.ppt

* * ⅰ贝类动物毒素的高通量筛选：其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验考察受试样品的功效。 ⅱ 酵母双杂交的方法高通量筛选：筛选干扰N型Ca2+通道的小分子，寻找新型Ca2+通道拮抗剂。 离子通道病：指离子通道的结构或功能异常所引起的疾病。某一疾病或药物引起某一种或几种离子通道的数目、功能甚至结构变化，导致机体发生或纠正某些病理改变。 （2）细胞水平药物筛选模型 观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括：内皮细胞激活；细胞凋亡；抗肿瘤活性；转录调控检测；信号转导通路；细菌蛋白分泌；细菌生长。 （4）影响HTS的因素 HITS=[compounds][assays][diversity]：发现先导化合物的机会 [compounds]：数量、种类 [assays]：检测方法、药理模型、靶标 [diversity]：多样性 高通量筛选的基础 （5）高通量筛选技术的优点 快速—每天筛选数万药次； 微量—筛选样品需要量为微克级； 灵敏—准确判断筛选样品的活性和选择性； 经济—筛选费用低； （6）局限性 高通量筛选作为药物筛选的一种方法，并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。 首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用； 其次，用于高通量筛选的模型是有限的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。 虽然其发现活性化合物的速度快，但是其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征，只得到有限的数据，初筛得到的阳性结果需要进一步确认。 Ⅱ虚拟药物筛选（virtual screening） 定义：针对重要疾病特定靶标生物大分子的三维结构或定量构效关系(QSAR)模型，从现有小分子数据库中，搜寻与靶标生物大分子结合或符合QSAR 模型的化合物，进行实验筛选研究。 虚拟筛选目的：发现有苗头的化合物，集中目标，降低实验筛选化合物数量，缩短研究周期，节约研究经费。 组成：虚拟药物筛选应用软件，理论方法，研究对象，操作过程，结果分析评价。 始于上世纪60 年代，应用于创新药物先导结构的发现和优化并取得突破性进展始于80 年代中期。主要推动力有三方面： 分子生物学和结构生物学的发展，使得一些靶标生物大分子的功能被阐明，三维结构被测定； 计算机科学的发展，出现了功能先进的图形工作站，极大地提高了计算和数据分析的速度和精度； 许多药物分子设计新方法快速发展，如基于生物大分子三维结构的分子对接(molecular docking)方法和基于药物小分子的三维定量构效关系分析方法和数据库搜寻方法等。 1 虚拟药物筛选历史 分子对接(molecular docking)示意图 即基于小分子的药物设计(ligand-based drug design, LBDD)：根据现有药物的结构、理化性质与活性关系(SAR)的分析，建立定量构效关系(QSAR)或药效基团(pharmacophore)模型，预测新化合物的活性； 2 药物设计方法分类：两类 基于受体生物大分子结构的药物设计(structure-based drug design, SBDD）:根据受体生物大分子(蛋白质、核酸等) 的三维结构（晶体结构、核磁共振(NMR)结构、低温电镜结构或计算机模拟结构）用理论计算和分子模拟方法建立小分子－受体复合物的三维结构，预测小分子－受体的相互作用，在此基础上设计与受体结合(活性)口袋互补的新分子。 (1)收集文献上发表的小分子化合物结构的信息，组成二维(2D)小分子数据库。对每个小分子进行原子类型和化学键归属，将2D结构转变成三维(3D)结构并进行结构优化，组成3D小分子数据库； (2)对生物大分子(蛋白质)进行质子化和原子电荷归属，并进行结构优化，确定小分子结合位点，构建计算网格； (3)将3D小分子数据库中的每个化合物对接到生物大分子的活性位点，并进行打分——计算小分子－生物大分子的结合强度Ki(结合自由能) ； (4)根据打分的结果挑选化合物(打分比较高的分子)，进行类药性评价，选择化合物进行生物实验测试。 3 基于分子对接的虚拟筛选的过程 4 虚拟筛选的意义 提高了筛选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期。 目前药物研究的靶标大约500个左右； 10年后可能达到1000个以上的新靶点。 现有的有机小分子(天然产物和合成化合物)大约有2000万。 5 我国虚拟筛选的研究现状 目前全国已有80 余家院校和研究机构建立了药物设计(包括农药设计)研究部门，从事药物