限制性核酸内切酶消化质粒DNA.PPT

* * 实验二 限制性核酸内切酶消化质粒DNA 一、实验目的 1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。 2.了解酶切反应条件。 二、实验原理 限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核酸内切酶。 在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双链DNA分子断开。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（ 3 ’突出和5 ’突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ、HindⅢ 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 二、实验原理 EcoRⅠ 5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 5ˊ-G AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ 3ˊ-CTTAA G-5ˊ + HindⅢ 5ˊ-A↓AGCTT-3ˊ 5ˊ-A AGCTT-3ˊ 3ˊ-TTCGA↑A-5ˊ 3ˊ-TTCGA A-5ˊ + 质粒是细菌细胞内独立于染色体之外能自主复制的双链环状DNA分子。本实验用到的是pGEM-T Easy质粒。 二、实验原理 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 质粒有3种构型： 1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA ； 2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂； 3、线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂。 这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。 二、实验原理 EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-T Easy质粒DNA切开成为线性DNA。用未经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以推测酶切是否成功。 _ + 二、实验原理 Marker 1 2 图片说明： 1 未经酶切的质粒DNA 2 经EcoRⅠ或HindⅢ酶切后的线性DNA和目的DNA 3000bp 2000bp 1000bp 600bp 500bp 目的DNA 三、仪器与试剂 主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪 主要试剂：限制性核酸内切酶（ EcoRⅠ、HindⅢ ） 10×酶切缓冲液 琼脂糖 上样缓冲液 0.5×TBE缓冲液 质粒DNA 四、实验步骤 1.建立反应体系：0.5mL无菌的EP管 (总体积20μL) 2.37℃，水浴1h。 3.低速短暂离心。 4.加4μL上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳（100V,40min）。(取12μL点样) 无菌双蒸水 12μL 质粒 2μL 10×buffer酶切缓冲液 2μL 内切酶 EcoRⅠ 4μL 轻轻混匀，低速短暂离心 质粒酶切电泳图 五、实验结果 六、注意事项 1、操作时注意： （1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。 （2）要求在冰上操作，并充分混匀。 （3）打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。 （4）水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。 六、注意事项 2.内切酶的使用时注意： (1)不使其污染与浪费； (2)注意加样顺序； (3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。 六、注意事项 3.质粒DNA对结果的影响： 作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制作用可通过下列方式克服： （1）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA）、 （2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂 （3）延长反应时间 4、反应缓冲液的影响 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg