胶乳微球偶联蛋白的使用中常见问题及解答.doc

胶乳微球使用中常见问题及解答 以下问题是我们用户在使用过程中遇到的问题，我们咨询了国外的技术人员，这是他们的答复） 问：产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗？ 答：产品说明书中给出的胶乳粒径（Diameter）是平均粒径。 问：如何选择胶乳微球的粒径？ 答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。 问：一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少？ 答：整个测定体系中，微球的浓度大约在0.01%左右，当然这与试剂本身规定的线性有关系。 问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？ 答：需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关，一般70nm左右的微球大概13000g/min 30min以上，粒径越小所需时间越长，离心力越大。 问：蛋白（抗体）与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？ 答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以10-20分钟为宜，长时间的活化反而会降低偶联效率。 问：由于抗体不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？ 答： 事实的确如此，当然由于抗体的空间折叠方式和FC端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大。 问：胶乳微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？如何控制和避免？ 答：这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻断剂 解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。 3、胶乳的自凝现象如何控制和避免？ 答：胶乳自凝与许多因素有关，如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平，使得表面的价负荷被掩蔽，胶乳微球之间发生接触，于是便产生凝集，故高离子强度的缓冲溶液不应使用，缓冲溶液的的浓度不要超过50mM，但有些CML胶乳微球具有高电荷密度，则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球，不能使用阳电荷的缓冲溶液如Tris缓冲溶液，因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时，悬浮介质的pH值应至少保持在比胶乳微球表面基团的pKa值高1-2pH单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定，故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜，胶乳微球也不能受冷冻，否则会凝集。 问：抗体偶联至羧基微球后，即时检测效果很好，但置于37度 2天后，抗体活性似乎下降很大，什么原因？ 答：这种情况大概是以下情况所致：一、乳胶微球含有表面活性剂，导致胶乳自身出现自凝现象，可以通过显微镜进行观察，如果是胶乳含有活性剂，则在偶联之前进行清洗，保证偶联的胶乳微球没有聚集。二、如果共价结合反应是成功的而抗体活性失活如此迅速，最常见的原因是抗体质量差或试剂过期所致，而且还会出现一个自由流动白色粉末、持续性团块等，这表表明试剂已被污染。 问：胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性最好？ 答：一般常用的是低浓度的Goods缓冲液，如MOPSO、MES、HEPES等缓冲液，浓度在25-50mmol/L。 问：胶乳微球偶联抗体后与抗原进行反应，但是反应不明显，是什么原因所致？ 答：⑴抗原和抗体不匹配；⑵包被的抗体量下足；⑶抗体使用量虽多，但偶联效率低。 问：如何选择胶乳试剂的波长？ 答：胶乳试剂随着检测波长的增加吸光度降低，为了保证试剂检测过程中不超过吸光度的检测限，一般胶乳试剂的波长选择在546-600nm左右。 微球表面基团种类及其反应 微球表面基团 活化剂 与之反应之基团 生成化学键类型 羧基 EDC；EDC/(sulfo)NHS； CDI；CMPI 伯氨；仲氨 酰胺；仲胺 氨基 交联剂 硼氢化氰 羟基琥珀酰亚胺酯；醛基 卤乙酰基；氯甲基酯 酰胺；仲胺或叔胺 酰肼 交联剂 硼氢化氰 羟基琥珀酰亚胺酯 醛基 二酰基肼 还原型腙 环氧基 ? 氨基；巯基；羟基 仲胺；硫醚；醚 醛基 硼氢化氰；苯胺 酰肼；肼；氨氧基 腙；腙；肟 巯基 交联剂；四硫磺酸钠 4,4-联吡啶二硫醚 马来酰亚胺；卤乙酰基；二硫吡啶；；环氧基；羟基琥珀酰亚胺酯；乙烯砜 硫醚；硫醚；二硫化物 二硫化物；硫醚；硫醚 硫醚 羟基 CDI；对甲苯磺酰氯 溴化氰；DSC 双环氧基化合物 氨基；巯基；羟基 胺；仲胺；硫醚；醚 金属基 硫醇或二硫醇 硅羟基