微生物快速检测方法.PPT

* 微生物快速检测方法简介 常见微生物检测项目 常规微生物项目 细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、霉菌及酵母菌 致病微生物项目 沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等 传统计数改良法 1、培养膜法 2、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数 3、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测 快速检测的新方法 1、ATP生物荧光法 2、电阻抗法 3、颜色变化 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量法 常规微生物检测方法 培养膜法_快速检测纸片技术 原理 二片塑料膜构成，上薄为盖，下厚为培养基。 操作方法： 　检样稀释→取1ml滴于下膜正中央→盖上膜→扩展器压成20cm2圆圈 →37℃培养24h →计数(显色的斑点) 培养膜法_快速检测纸片技术 优点： 可节约玻璃仪器、培养基。 可节省培养基等试剂的配置灭菌和玻璃仪器灭菌和清洗的时间、人力和费用。 因为有显色剂和小方格，计数方便。 节约稀释的繁琐动作。 可快速测试致病菌，节省大量的实验步骤。 缺点 成本比传统方法要稍高些。 测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养时间。 培养膜法_快速检测纸片技术 应用 细菌总数 　测试片中含有一种红色指示染剂，使所有菌落易认别计数。 大肠菌群 测试片中含有指示剂，使菌落为红色，且有气泡产生。 大肠杆菌 　指示剂可使所有菌落为红色，并可留住大肠杆菌产生的气泡。 　24小时可确定大肠杆菌数。 霉菌和酵母菌计数 　测试片中加入的抗生素，可以抑制细菌生长；指示剂使酵母菌易认别计数；霉菌可产生特有的色泽。 金黄色葡萄球菌 　使用了具有热稳定的核酸酶反应片，核酸酶反应产生的粉红色环带色围着一个红色或兰色菌落即为金黄色葡萄球菌，26小时可确认结果。 培养膜法_快速检测纸片技术 螺旋平板法 DWS螺旋平板接种仪 自动菌落计数仪 原理 　 样品制备的菌悬液在琼脂表面形成阿基米德螺旋型轨迹。 当用于分液的空心针从平板中心移向边缘时，菌液体积减 少，注入的体积和琼脂半径间存在指数关系。培养时菌落 沿注液线生长。用一计数的方格来校准与琼脂表面不同区域有关的样品量，计数每个区域的已知菌落数，在计算细菌浓度。 螺旋平板法 平皿旋转 接种针往外移动 同时自动将样品 稀释1000倍 阿基米德螺旋型轨迹 螺旋平板法 优点 与传统方法相比，无需稀释梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。 缺点 检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。 需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。 螺旋平板法 滤膜法 滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。 优点 　灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。 缺点 需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。 ATP生物荧光法 原理 ATP＋萤光素+萤光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化萤光素+光 应用 用于食品生产线和管道进行快速清洁程度检测。 用于水质检测。 改良后用于食品的商业无菌检测或终产品检验。 10秒获得结果 涂抹采样 混合:震荡5s 检测 表面清洁度/水质检测 ATP生物荧光法 ATP法检测成品的优缺点 优点：大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。 缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，有存在假阴性的可能。 ATP生物荧光法 电阻抗法测定细菌总数 原理 　供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。阻抗变化的产生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值。 　　M=(R0-RT)/R0×100% 其中R0表示开始时培养基的阻抗值 　　RT表示任意时刻培养基的阻抗值 　　M表示培养基电阻减少的百分数。 电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位的对数Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。 电阻抗法测定细菌总数 优缺点： 电阻抗法较省力，样品细菌数在4～18小时内出结果。但对于菌数太低的不好，样品中还不能用防腐剂，否则结果是乱七八糟的。 电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管一只。 电阻抗法测定细菌总数 通过颜色变化检测 微生物生长导致培养基pH值发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层 　的颜色变化