DNA提取原理和方法.PPT

DNA提取方法简介 DNA提取的几种方法 　基因组DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 DNA提取的几种方法 　非基因组DNA的提取 　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　 　线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 　CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP40 β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 基因组DNA－ CTAB法 PVP（聚乙烯吡咯烷酮） PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。 在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。 　CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组DNA－ CTAB法 SDS法原理 基因组DNA－SDS法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 　组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH 8.0 ） 　NaCl SDS 　终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2% SDS法DNA提取缓冲液 2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右 SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液 组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 　根据细胞裂解方式的不同有： 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 　根据核酸分离纯化方式的不同有： 　硅质材料 　 　阴离子交换树脂 　磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离