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核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系 采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔 离心分离两相时,应保证一定的转速和时间(猕猴桃大提,10000转20min) 针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 核酸分离、纯化 蛋白质的去除: 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等) 高盐洗涤 蛋白酶处理 多糖的去除: 高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min。 核酸分离、纯化 多酚的去除: 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂:如PVP、PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合 核酸分离、纯化 盐离子的去除: 70%的乙醇洗涤 核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),有利于充分沉淀 沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等 晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥) 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase pH值为8.0,可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质(具体方法见前) 重新沉淀DNA,让酒精充分挥发 增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次) DNA提取常见问题 问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。 原因 对 策 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融 DNA提取常见问题 问题二:DNA降解。 对 策 原因 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜(幼嫩)的材料 动植物要匀浆研磨充分;G+菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增加PK的用量) 低温沉淀,延长沉淀时间 加辅助物,促进沉淀 洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒 DNA提取常见问题 问题三:DNA提取量少。 对 策 原因 猕猴桃DNA提取实例 1.CTAB配方如上,配制好备用,65度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 2.65°水浴一个小时 3.氯仿:乙醇:异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟,尽量把丝状物压紧,避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ,75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解,加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 猕猴桃基因组DNA 第一部分:DNA提取方法简介 第二部分:DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 内容 第三部分:RNA提取方法简介 第四部分:RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 第三部分:RNA提取方法简介 RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法 原理: 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解,同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放; 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离; 有机溶剂抽提,沉淀,得到纯净RNA。 RNA提取的通用方法 * 你们好 核酸提取及常见问题分析 第一部分:DNA提取方法简介 第二部分:DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 内容 第三部分:RNA提取方法简介 第四部分:RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 核酸是遗传信息的载体,是
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