生物素-亲和素反应的放大技术.PPT

生物素-亲合素放大技术 第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记 　一、理化特性 　二、亲合素（或链酶亲合素）的标记 第一节 生物素的理化性质与标记一、活化生物素二、活化生物素标记蛋白质 第三节 生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度　二、特异性三、稳定性　四、适用性五、其他 思考题 小结 第四节 生物素-亲合素系统的应用一、生物素-亲合素系统基本类型及原理二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用 生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。 BAB BA ABC 生物素（维生素H） 动、植物组织中广泛 分布,卵黄和肝含量高 分子量小，244.31 D I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合 Ⅱ环为噻吩环， C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构 I 咪唑酮环 Ⅱ 噻吩环 羧基:可用于活化为其他衍生物 第一节 生物素理化性质与标记 一、活化生物素 生物素侧链的末 端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生物) 为何要活化？ 活化生物素 活化生物素易 与抗原、抗体、 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物 标记蛋白质氨基的活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素 标记核酸的活化生物素 活化生物素 标记蛋白质氨基的活化生物素 BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸（碱性AA）的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质 生物素 N-羟基丁二酰胺 碳二亚胺 生物素羟 基琥珀酰 亚胺酯 (BNHS) 如何减小空间位阻 长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。 生物素分子量小，当与抗体或酶形成 生物素标记结合物后，由于大分子蛋白 的空间位阻效应，可对生物素与亲和素 的结合以及BAS的应用效果造成干扰。 标记蛋白质醛基的活化生物素 生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)： 能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素 标记核酸的活化生物素 光生物素(photobiotin)光敏物质 侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针，用于DNA或RNA的标记。 生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP） 作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法（DNase I和DNA聚合酶I）掺入到双链DNA中。 BNHS和BHZ 可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。 目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。 特性： 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放大作用的物质基础）； BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质, BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变； 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低； 二、活化生物素标记蛋白质 注意事项： 选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力 第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记 　　　亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。 结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基 PI 10.5 6 结合位 色氨酸 色氨酸 生物素 4 4 Ka 1015 1015 活性