疟原虫血片制作及染色.PPT

血膜染色（二）染色的原理 染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。 各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸组成。不同的氨基酸均含有氨基（NH2）和羧基（COOH）。在游离状态时，氨基（NH2）获得一个氢离子成为带阳电的离子（NH3 + ）；而羧基失掉一个氢离子成为带阴电的离子（COO — ）。 血膜染色（二）染色的原理 主要染料都含有美蓝、伊红和美蓝氧化后的天青。 美蓝的有色基团带阳离子，是一种碱性染料，用的是盐酸美蓝。溶于水后离解为带阴电的氯离子和能着色的美蓝阳离子。 伊红的有色基团带阴离子，是一种酸性染料，染色用的是伊红钠盐。溶于水中时离解为带阳电的钠离子和带阴电的伊红离子。 天青为美蓝氧化而成。虽为碱性染剂，在染色中起染媒作用。 血膜染色（二）染色的原理 伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沈淀物染成红色。 美兰主要离解为碱性的美兰离子，在遇到酸性蛋白质如疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等即可结合染成兰色。 血膜染色（二）染色的原理 美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡蓝色的结构染上显著的酸性染剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既蓝又红的紫蓝色，而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。 血膜染色（二）染色的原理 染色化学反应反应的示意图： 疟原虫细胞浆的阴离子（COO—）＋ 美蓝阳离子—→呈蓝色 ┏天青（染媒作用） 疟原虫核的阳离子（NH3+）＋┫ －→ 呈紫红色 ┗伊红阴离子 血膜染色（二）染色的原理 蛋白质本身是阴阳电荷是相等，带有两基性的。所以其所带阴阳电荷的数量可受周围液体的酸碱度（PH）而改变，在偏酸的溶液中阳离子增加，易于伊红结合，着色偏红。在偏碱的溶液中阴离子增加，易于美蓝结合，着色偏蓝。这就说明了为何配制染液的酸碱度直接影响了血片染色的质量，偏酸着色过红，偏碱着色过蓝。所以在染血片时稀释液要控制在PH7.2，最为适宜，疟原虫的结构才能清晰可见。 吉氏染色血片外观 偏 酸 偏 碱 标 准 1、吉氏染液的配制： 这是目前最常用的疟原虫染色剂，它具有方便、染色效果稳定的优点，也是我们推荐的染色方法。 将吉氏粉5g置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油250ml加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇250ml洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。 也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3 ~5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧瓶塞，置于室温内，每天用力摇动5分钟，3天后即可使用。 血膜染色（三）染液的配制和染色方法 疟原虫血片制作与染色 云南省寄生虫病防治所 赵晓涛 电子邮箱：zxt_423@163.com 办公室：疟疾防制科 0879-2141182 手机 QQ血膜制作 血膜染色 影响染色效果的因素 主要内容 血膜制作（血膜分类） 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。厚血膜上的血细胞是重叠堆积在玻片上面，而薄血膜上的血细胞则要求平辅在玻片上面。 门诊或现场发热病人血片 标本片 厚血膜 用血量约为4μl～5μl,涂制成直径0.8 ～ 1cm的厚血膜,由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。受影响较大的有大、裂殖体的形态。 由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的15～25倍。所以，我们推荐疟疾诊断（门诊检验及现场普查）应以检查厚血膜为主。 厚、薄血膜的优缺点及其适用范围 薄血膜 用血量约为1-1.5μl，涂制成2cm宽×2.5cm长面积的薄血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，适用于对疟原虫虫种的鉴定。 由于用血量少，为保证检测的敏感性，常耗时较多，不适用于大规模调查。特别在医院的检验室，由于要求在短时间内作出诊断，因而极有可能出现漏诊。 厚、薄血膜的优缺