神经组织的多重免疫标记技术.ppt

常见问题及原因分析 问题一 “无色片” 设立阳性对照 1）真阴性结果 Neuron GFAP 解决方案 设立阳性对照 (同一部位使用不同抗体进行检测） 2）假阴性结果 常见问题及原因分析 原因：①操作不当 ②抗体原因 常见问题及原因分析 问题二 “杂音染色” “杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样 1）调整抗体浓度 2）抗体孵育时间或温度 3）抗体覆盖完全，减少流失 4）组织切片漂洗时间、是否有气泡 1）全片着色 2）边缘着色 3）阴阳脸 4）灶片状着色 常见问题及原因分析 问题三 “背景过高” 解决方案 1）调整抗体效价 2）血清等进行封闭 3）充分漂洗 4）合宜的切片厚度 常见问题及原因分析 问题四 “非特异着色” 解决方案 1）新鲜组织、及时固定 2）一抗或二抗前封闭 3）掌握抗体孵育时间、温度 4) 避免抗体交叉反应 切片破损 切片刀痕 切片干燥 切片皱褶 切片脱落 常见问题及原因分析 体会 1、“痛己之不足”，忌不总结 2、“柳暗花明又一村”，忌盲目执着 3、“三人同行必有我师”，忌闭门造车 TEL：774562 科技大楼1607 Thank you * * * Use a section header for each of the topics, so there is a clear transition to the audience. * 神经组织的多重免疫标记技术 发展史 酶标抗体技术 辣根过氧化物酶技术 ABC法 免疫金银染色法 免疫电镜技术 免疫荧光技术 发展史 酶标抗体技术 辣根过氧化物酶技术 ABC法 免疫金银染色法 免疫电镜技术 原位杂交技术 免疫细胞化学 免疫荧光技术 应用 1）在细胞学方面，对于细胞抗原性物质能准确、敏感地进行检测 和定位。 2）在微生物学方面，主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。 3）在寄生虫学中，用来检测人体大多数寄生虫，且具有特异性高 和敏感性好等优点。 4）在临床病理学方面，可用来确定肿瘤的组织学发生，进行肿瘤的 转移性和特异性的鉴别，辅助识别肿瘤的良、恶性，癌前病变和癌。 5）自身免疫性疾病中，应用免疫荧光抗体间接法可以检出自身免疫疾病患者血中的自身抗体。 单一免疫组化染色 二、免疫荧光染色操作流程 三、常见问题及原因分析 一、多重免疫标记技术概述 多重免疫标记染色法原理 抗体与抗原高度特异性结合的原理， 在同一张切片上同时或先后标记2种以上的抗原，显示不同抗原的毗邻关系、伴随状况等。 * 特点 2、灵敏性 3、简便性 1、特异性 4、形态与功能的结合 定位、定性、定量的结合 基因水平与蛋白质水平的结合 细胞水平与超微结构的结合 ABC法标记技术 Fos/TH/GFAP 免疫电镜标记法 抗GFAP/NMDA-R Synapse Cx43/Cx32 Gap Junction 抗Cx43/NMDA-R Cx43 Hemichannel Cx43/Cx32 Gap Junction 兴奋神经元 三重免疫酶标记法 兴奋神经元 免疫阳性神经元 逆行标记神经元 三重标记神经元 HRP/Fos/TH 逆行追踪与免疫组织化学染色相结合三重标记法 四重免疫标记技术 段丽、陈良为、饶志仁、杨志军 三重免疫荧光标记技术 * 免疫组化操作流程 血清封闭 入一抗（同时，两种或以上），室温孵育 浸入与相应一抗相配的二抗，室温孵育（避光） 0.3% TritonX-100孵育 组织切片 灌注固定 显微镜下观察 组织脱水 灌注固定 * 目的 防止组织自溶，维持组织特有结构，防止抗原弥 散，保持组织细胞内抗原物质的不动性和免疫活性 固定剂 4% 多聚甲醛、戊二醛、乙醇、苦味酸 方法 浸泡固定、灌注固定 * * 免疫组化操作流程 血清封闭 入一抗（同时，两种或以上），室温孵育 浸入与相应一抗相配的二抗，室温孵育（避光） 0.3% TritonX-100孵育 组织切片 灌注固定 显微镜下观察 组织脱水 * * 免疫组化操作流程 血清封闭 入一抗（同时，两种或以上），室温孵育 浸入与相应一抗相配的二抗，室温孵育（避光） 0.3% TritonX-100孵育 组织切片 灌注固定 显微镜下观察 组织脱水 抗体孵育 第一抗体 种属、IHC、定位 第二抗体 种属 荧光抗体 * 免疫组化操作流程 血清封闭 入一抗（同时，两种或以上），室温孵育 浸入与相应一抗相配的二抗，室温孵育（避光） 0.3% TritonX-100孵育 组织切片 灌注固定 显微镜下观察 组织脱水 凤舞九天-褚华硕（Ol