2018免疫组库测序.ppt

IR-SEQ 目录 免疫组库（IR） 免疫组库测序技术 信息分析 1、免疫组库概念 免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。研究免疫组库就要测定免疫系统中的BCR和TCR的基因或RNA分子序列。 影响免疫组库组成的因素有很多种。比如年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。 根据淋巴细胞DNA来源的不同，对于免疫组库的研究分为以下几大类：健康人士一般采用抽取外周血的方式；特殊人群比如白血病人或者白血病细胞微小残留病（MRD）患者，为了深入研究其免疫组库的变化也将骨髓血作为淋巴细胞DNA的来源；刚出生的婴儿，其脐带血可以用于研究人在出生早期与母亲在免疫组库方面的联系与区别；而对于动物来说尤其是小型动物，脾脏也是常见淋巴细胞的DNA来源脏器。 以唾液和尿液作为淋巴细胞DNA来源的方式。  2、BCR B细胞受体（BCR）又称为免疫球蛋白（IG），它是由B细胞分泌的可以和抗原结合的蛋白质分子。成熟的B细胞可以将IG分泌到细胞外面以中和抗原。免疫球蛋白由两条重链（heavy chain, H），两条轻链（light chain, L）中间通过二硫键连接而成。重链（IGH）由 Variable（V），Diversity（D），Joining（J）和Constant（C）基因片段重组而来；轻链（IGL）只由V-J-C重组而来。重链（H链）又分为V区、C区、跨膜区及胞质区；而轻链（L链）则只有V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，各有3个CDR即CDR1、CDR2和CDR3。 决定B淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具多样性的重链CDR3区，其多样性的产生源于IGHV（51个功能性基因片段）末端-IGHD(23个功能性基因片段）-IGHJ前端（6个功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J连接时非模板依赖性核苷酸插入或剪切和体细胞高频突变等。 3、TCR T细胞受（TCR）是由T细胞分泌的膜蛋白分子，与BCR不同的是TCR只在细胞表面而不分泌出去。一个T细胞的TCR可以是α链和β链组成的，或者由γ链和δ链组成的。α链和γ链由V-J-C基因片段重组而来，β链和δ链由V-D-J-C基因片段重组而来，这也类似于BCR的重链和轻链。参与特异性免疫应答的T淋巴细胞主要是α/β T淋巴细胞，占外周Ｔ淋巴细胞的90-95%。TCR β 链CDR3在抗原特异性识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点，其编码基因位于人类7号染色体（7q34），全长620kb，由50多个可变区（V区）基因片段、2组上游D基因片段/下游恒定区（C区） 基因片段、6~7个J区基因片段组成，这些基因在T淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始T细胞阶段，D-J区片段连接为 DJ片段；在成熟T淋巴细胞阶段，V、D、J、C区基因片段相连成 VDJC片段。 据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重排以及TCR α/β链和γ/δ 链V区基因重排产生的TCR克隆数量高达1015-1018，构成多样性极其丰富的T淋巴细胞抗原受体库。不同T淋巴细胞克隆有不同序列或长度的TCR-CDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序列，从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异性免疫应答时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始T淋巴细胞增殖，TCR免疫组库多样性得以恢复和重建。 不同VDJ基因片段组合的多样化； 不同基因片段连接时随机插入删除造成连接的多样化，V(D)J连接区核苷酸的插入和删除，体现为互补决定区簇CDR3)序列多样性； 不同重链和轻链组合的多样化； 以及 B 细胞受体特有的随机高频突变。 4、BCR/TCR多样性产生机制 5、研究免疫组库的流程 提取样本DNA/RNA:根据所要研究的问题设计试验方案，提取血液或组织样本，分离B细胞或T细胞，然后提取和纯化DNA/RNA。 构建测序文库:根据不同实验情况加入不同扩增引物进行PCR扩增，从而扩增出想要测序的免疫基因，最后构建测序文库。 测序:利用二代高通量测序仪，如Roche 454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Mi Seq等进行测序。 信息分析:对测出来的序列数据进行信息挖掘，来发掘出生物学意义与结果。数据分析主要包括数据清理、质量控制、不同样本数据分离、序列比对、序列注释以及下游的各种分析。 二、免疫组库测序 1、免疫组库测序概念 免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，用多重PCR技术或5’RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（C