ITR缺陷对AAV病毒包装与感染力的影响.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2008, 35(2): 224~230 ITR 陷对AAV 病毒包装与感染力的影响* 1)** 2) 2) 1) 曹佐武 林 羿 程龙球 邹飞雁 1) 2) ( 暨南大学生殖免疫研究所，广州 5 10632， 暨南大学生命科学技术学院，广州 510632) 摘要 腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷性DNA 病毒，其基因组两端的两个倒转末端重复序列( ITR)是rAAV 包装复制所必 需的自身结构 ITR 容易缺失并影响病毒颗粒的包装和感染力 比较两个ITR 完整的和一端ITR 缺失的AAV 病毒发现，一 端ITR 缺失的AAV 载体质粒包装病毒的效率明显比ITR 完整的质粒低 用这两种AAV 病毒感染293 细胞、HeLa 细胞和小 细胞肺癌细胞NCI H446 细胞，显示两个ITR 完整的AAV 病毒感染细胞的能力明显比一个ITR 缺失的病毒强 说明ITR 缺 失对AAV 病毒的包装和感染力都有明显的影响 因此，筛选两个ITR 完整的AAV 载体质粒，并稳定其基因组的结构，对 提高病毒生产的产量和增强病毒的感染力都有显著的价值 关键词 腺相关病毒，倒转末端重复序列，病毒包装 学科分类号 R394.8，Q3 11.8 腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV) 是一 有前途的基因治疗载体之一 然而，作为基因治疗 种复制缺陷性DNA 病毒，仅由3 种包被蛋白和一 的载体，rAAV 病毒也有一些局限性 rAAV 病毒 条DNA 单链构成 它的复制需要辅助病毒如腺病 载体制备程序复杂、包装量低 而且，AAV 的感 [1] 毒的协助 AAV 基因组为线型的单链DNA，每条 染能力也较弱 ，实际应用需要较大的剂量 尽管 单链DNA 由4 680 个碱基构成，包括两端 145 bp 多年来努力改进rAAV 的生产，如用腺病毒辅助质 的倒转末端重复序列( ITR) 和中间的2 个开放性阅 [2, 3] 粒代替腺病毒，调整Cap 与Rep 蛋白的比例 等， 读框 生产效率仍然很低 优化AAV 的制备方法，提高 两端的ITR 是AAV 复制、包装所必需的最少 生产效率和病毒活性，具有很大的应用价值 的自身序列 序列中CG 含量达80% 以上，其前 AAV 是复制缺陷性DNA 病毒，只要通过辅助 125 bp (1～125) 序列依次可分为A, B, B , C , C, A 病毒或质粒额外提供Rep 和Cap 蛋白，凭借AAV 等不同的区段( 图1b)，其中B 与B ，C 与C 反向 基因序列中存在的两个自身ITR 结构，质粒中的 互补可形成T 形发夹结构，作为AAV 的DNA 自 AAV 基因组即可释出并包装成新的病毒粒子[4] 而 我复制的起点，随后的20 bp 形成特有的D 序列， 且，与其互补的单链DNA 也可被包装成病毒颗 [5] 且有 Rep 蛋白结合位点( RBS) 和末端解链位点 粒 ITR 还是形成环形AAV 中间体的关键结构 ， (trs)，此两个位点和Rep 蛋白的结合与AAV 定