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高通量测序技术
高通量量测序技术及其发展现状
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(Next-generation sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑,该技术可以对数百万个DNA 分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,因此也称其为深度测序(deepsequencing)或下一代测序技术(next generationsequencing,NGS)。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。
高通量量测序技术的类型及原理
目前,所说的高通量测序技术主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术。
2.1 第二代测序技术
2005年,454 Life Sciences 公司( 现已被Roche公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统,开创了第二代测序技术的先河。该技术的原理是酶级联化学发光反应: 首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交,并与DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP,ATP 就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD 检测后通过软件转化为一个峰值,峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。此后,Illumina 公司和ABI 公司相继推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。它们与焦磷酸测序法的原理类似,核心思想都是边合成边测序(sequencing by synthesis),即生成新DNA 互补链时,要么加入的dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光,要么直接加入被荧光标记的dNTP 或半简并引物,在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值,获得互补链序列信息。由此可见第二代测序技术无需进行电泳,操作极为简便。这不但大大节省了成本和时间,而且可以在芯片上进行高通量分析。该测序技术单次反应可以对数以百万计的样品进行分析,这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。假如利用这种方法进行人类基因组的测序,那么在数天内就可以完成,而且成本也将大大降低。
Illumina公司目前拥有三种测序平台,分别为HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx ( / );ABI 公司则主要是SOLiD 3 和SOLiD 4 两个测序平台。HiSeq 2000 测序平台单次反应可以读取200G的数据,而SOLiD 4 仅为100G 左右。从通量这个最直观的数字看来,HiSeq 2000领先于SOLiD 4。更高的通量就意味着更低的成本,利用HiSeq 2000以30倍的覆盖度对两个人类基因组进行测序,每个基因组的费用不到1万美元(http://www.illumina
.com/systems /hiseq_2000.ilmn)。就测序读长来说,454 测序平台读长最长,目前已经达到400nt。因此,454 平台比较适合对未知基因组从头测序,但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa 测序读长较454 短,仅为100nt 左右,但测序通量高、价位低,适合基因组重测序等。SOLiD 读长也较短,但测序精度较高,特别适合SNP 检测等。
2.2 单分子测序技术
在第二代测序平台不断完善和广泛应用的同时,以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的更新的测序技术也初显端倪。2008年4月Helico BioScience公司的Harris等在Science上报道了他们开发的基于全内反射
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