菌落总数测定操作步骤.doc

食品中菌落总数测定操作步骤 器皿、药品试剂准备 检查高压灭菌锅水水位（完全淹没发热管且与锅底支架相平），通电预热，检查恒温水浴锅水位，通电，设定为46度，加热恒温； 取8套直径90毫米的培养皿用报纸包裹严密或用布袋封装，放入高压灭菌锅； 称量4.3克氯化钠于500毫升三角瓶中，用500毫升量桶量取500毫升水加入其中，溶解； 取一250或300毫升的三角瓶、三支试管，用量桶量取225毫升上述（第3步所培溶液）生理盐水于三角瓶中，用10毫升刻度吸管分别量取9毫升上述（第3步所培溶液）生理盐水于三支试管中，用透气塞或棉塞封口，放入高压灭菌锅； 称取4.7克平板计数琼脂培养基于250毫升三角瓶中，加200毫升水，溶解，用透气塞或纸封口，放入高压灭菌锅； 取6支1毫升刻度吸管，用报纸包裹严密或用布袋封装，放入高压灭菌锅； 盖好锅盖（双手对角拧紧），使密闭步漏气，打开排气阀，排尽冷空气，关闭排气阀，观察压力表指针变化，从压力表指针达121度时开始计时，使温度保持121度15分钟（根据不同的型号需手动或自动控制），15分钟后断电，自然冷却使压力表指针回到零位。 样品稀释和培养 打开超净工作台风机； 打开压力锅盖，取出包裹严密的8套直径90毫米的培养皿，放入超净工作台； 取出装有225毫升生理盐水和200毫升培养基的三角瓶（保持封口密闭）、编号-1，放入恒温在46度的水浴锅中； 取出装有9毫升生理盐水的支试管（置于试管架上），分别编号-2、-3、K，放入超净工作台； 取出包裹严密的6支刻度吸管，放入超净工作台； 无菌操作称取25克样品，于超净工作台中放入装有225毫升无菌生理盐水的三角瓶中，用均质器处理1至2分钟，配成-1的阳平均液； 用1毫升灭菌刻度吸管从-1样品均液中量取1毫升放入-2试管，混匀，制成1：100的样品均液； 用1毫升灭菌刻度吸管从-2样品均液中量取1毫升放入-3试管，混匀，制成1：1000的样品均液； 打开培养皿包裹物，培养皿分别编号1：100、1：1000、1：10000、空白（各2皿）； 对应试管和培养皿的编号，用刻度吸管分别吸取1毫升样液于对应的培养皿中； 将46度恒温的培养基均匀倒入上述8个培养中，每皿20至25毫升； 静置，冷凝后翻转培养皿，放入36度培养箱培养48小时，计数。 菌落计数 用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示。 选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： 示例： 稀释度 1：100（第一稀释度） 1：1000（第二稀释度） 菌落数（CFU） 232，244 33，35 N=∑C/(n1+0.1n2)d =(232+244+33+35)/［2+(0.1×2)］×10-2 =544/0.022 =24727 上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。 6 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7 若所有稀释度的平均菌落数小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 8 若所有稀释度（包括液体样品原液）平均均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 9 若所有稀释度的平均菌落数均不在30CFU~300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 10 菌落总数的报告 11 菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 12 菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数：也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 13 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 14 若空白对照上有菌落生长，则此次检测